miR—122调控LAMC1表达与肝癌细胞迁移侵袭相关性研究

[摘要] 目的 探讨miR-122调控LAMC1表达与肝癌细胞迁移侵袭相关性研究。 方法 选取人正常肝细胞株LO2、肝癌细胞株HepG2和高转移能力肝癌细胞株SMMC-7721，构建 miR-122 mimics稳定表达载体并对其进行转染，Real-Time PCR检测各组细胞株内microRNA-122含量；CCK-8法检测细胞存活率，流式细胞仪检测细胞凋亡；划痕实验检测肝癌细胞迁移侵袭能力；生物信息学预测、荧光报告载体实验Real-Time PCR检测层粘连蛋白γ1（Recombinant laminin gamma 1，LAMC1）mRNA水平变化。 结果 与对照组人正常肝细胞株LO2相比，miR-122过表达后，肝癌细胞株HepG2和高转移能力肝癌细胞株SMMC-7721细胞存活率显著降低，细胞凋亡率显著升高，LAMC1 mRNA含量显著降低，肝癌细胞株HepG2和高转移能力肝癌细胞株SMMC-7721细胞侵袭和迁移能力显著下降，差异有统计学意义（P<0.05）。 结论 上调miR-122表达可通过调控LAMC1表达抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭。

[关键词] 小分子核糖核酸-122；肝癌；LAMC1；迁移；侵袭

[中图分类号] R735.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2018）22-0027-05

[Abstract] Objective To investigate the correlation between LAMC1 expression regulated by miR-122 and tumor cell migration and invasion. Methods Human normal hepatocyte cell line LO2， HepG2 cell line and SMMC-7721 cell line with high metastatic potential were selected， and the stable miR-122 mimics expression vector was constructed and transfected. Real-Time PCR was used to detect the expression of microRNA-122； Cell viability was detected by CCK-8 assay； Cell apoptosis was detected by flow cytometry； Scratch assay was used to detect the migration and invasion ability of hepatocellular carcinoma cell； Bioinformatics prediction and fluorescence reporter assay Real-Time PCR detected Protein γ1 （Recombinant Laminin Gamma 1， LAMC1） mRNA level changes. Results Compared with the normal human hepatocyte cell line LO2， the survival rate of HepG2 cells and SMMC-7721 cell lines with high metastatic potential were significantly decreased after miR-122 was overexpressed， and the apoptosis rate was significantly increased. The mRNA levels of HepG2 and SMMC-7721 were significantly decreased. The cell migration and invasion ability of HepG2 and SMMC-7721 were significantly decreased. The difference was statistically significant（P<0.05）. Conclusion The up-regulation of miR-122 expression can inhibit the proliferation， migration and invasion of hepatocellular carcinoma cells by regulating the expression of LAMC1.

[Key words] Small molecule RNA-122； Liver cancer； LAMC1； Migration； Invasion

原发性肝癌是一种常见的严重危害人类健康的恶性肿瘤，其发病率近年来在世界范围内逐年上升，严重危害患者的生命健康[1，2]。肝癌起病隐匿，临床早期无明显的症状或临床症状缺乏特异性；同时肝癌发病进展迅速，具有高侵袭性和高复发性，导致其临床治疗难度大，预后极差[3-5]。microRNAs近年来已经发展为一个生物肿瘤治疗领域的新靶点。microRNAs作为基因表达的调节剂，其广泛参与并有效涉及多种生物及细胞的增殖、分化、凋亡代谢等过程[6-8]。miR-122作为肝脏特异性表达的microRNAs，其过表达可有效降低肝癌细胞的特异性，抑制肝癌细胞的分化周期，并能增强肝癌细胞对药物的敏感性，但其对于肝癌细胞的具体调控机制仍未阐明[9-12]。本研究中，我们通过上調肝癌细胞内miR-122表达，分析检测其对肝癌细胞的增殖凋亡和迁移侵袭的影响，旨在探讨miR-122对肝癌细胞迁移侵袭的调节作用和其对肝癌细胞内层粘连蛋白γ1（LAMC1）调控作用。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

美国培养物保藏中心（ATCC，Manassas，VA）购买人正常肝细胞株LO2、肝癌细胞株HepG2和高转移能力肝癌细胞株SMMC-7721。miR-122质粒、LAMC1及Real-Time-PCR配套引物（广州RiboBio公司）；CCK-8试剂盒（日本同仁化学研究所）；TUNEL凋亡试剂盒（上海碧云天生物有限公司）。

1.2 细胞培养

人正常肝细胞株LO2和肝癌细胞株HepG2用DMEM+10%胎牛血清、37°C、5%CO2细胞培养箱中培养，高转移能力肝癌细胞株SMMC-7721细胞用RMPI 1640+10%胎牛血清、37°C、5%CO2细胞培养箱中培养；3种细胞正常传代后提取细胞样品、PBS洗涤2次后转移入EP管中，冰上裂解15 min后超声破碎细胞，离心15 min，取上清液作为蛋白样品。

1.3 细胞miR-122mimics质粒转染[13]

慢病毒质粒（Lv-miR-122）与对照scarmble RNA的病毒质粒（Lv-Ctrl）连同包装质粒pRRE、pRSV-REV、pCMV-VSVG通过磷酸钙转染法转到293T细胞，48 h收集上清液，冷冻超速离心获得病毒浓缩液。人正常肝细胞株LO2、肝癌细胞株HepG2和高转移能力肝癌细胞株SMMC-7721接种于12孔板加入病毒上清液和polybrene（8 μg/mL） 选择感染16 h后更换为常规培养基继续培养，以绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）为荧光标记慢病毒感染，72 h时用荧光显微镜观察报告基因的表达情况，荧光率即为阳性感染率。

1.4 CCK-8法检测细胞存活率

将转染后的人正常肝细胞株LO2、肝癌细胞株HepG2和高转移能力肝癌细胞株SMMC-7721细胞制备成细胞悬液并接种到96孔板中，37℃、5%CO2条件下培养箱过夜培养。加入10 μL CCK8，按说明书操作进行细胞培养和测定450 nm波长处OD值，计算细胞存活率。

1.5 TUNEL流式细胞术检测细胞凋亡率

将转染后的人正常肝细胞株LO2、肝癌细胞株HepG2和高转移能力肝癌细胞株SMMC-7721细胞制备成浓度为1×106细胞悬液接种于6孔板中培养，分别加入FITc标记的AnnexinV和PI，按试剂盒说明书进行操作和测定激发波长488 nm，收集波长630 nm的细胞的荧光强度，检测肺癌细胞的凋亡百分比。

1.6 Real-Time PCR方法检测miR-122和LAMC1水平变化

将转染后的人正常肝细胞株LO2、肝癌细胞株HepG2和高转移能力肝癌细胞株SMMC-7721细胞制备成浓度为1×106细胞悬液接种于6孔板中培养，Trizol法提取细胞内总RNA。按照试剂盒说明书进行逆转录成cDNA，并用SYBR Premix Ex TaqⅡ试剂盒扩增和实时荧光定量Real-time PCR分析。分析：通过计算miR-122和LAMC1基因的循环阈值（CT值）确定各个基因的表达含量。

1.7 划痕实验检验细胞迁移和侵袭[14]

取人正常肝细胞株LO2、肝癌细胞株HepG2和高转移能力肝癌细胞株SMMC-7721细胞及miR-122病毒转染后的3种细胞接种于96孔板上，第2天更换低浓度血清培养基，将划痕仪对准96孔板的下端中央部位，向上轻推形成划痕。用无血清培养基轻轻漂洗2～3遍，加入低浓度血清培养基（如0.5%FBS），37℃、5% CO2培养箱培养，观察24 h后细胞的迁移和侵袭能力。

1.8 miR-122靶基因预测[15]

应用TargetScanHuman、FindTar等生物信息学软件预测miR-122的靶基因。

1.9 统计学分析

采用SPSS22.0软件进行数据处理，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，采用单因素方差分析和t检验比较，计数资料采用[n（%）]表示，采用χ2检验比较，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 肝细胞内miR-122的表达量

对照组人正常肝细胞株LO2 miR-122的表达量（1.00±0.00）相比，肝癌细胞株HepG2 miR-122的表达量（0.79±0.06）和高转移能力肝癌细胞株SMMC-7721细胞内miR-122的表达量（0.64±0.05）明显降低，差异有统计学意义（F=482.50，P=0.00）。见图1。

2.2 miR-122过表达对肝癌细胞存活率的影响

与对照组人正常肝细胞株LO2相比，miR-122过表达后，肝癌细胞株HepG2和高转移能力肝癌细胞株SMMC-7721细胞存活率显著降低，差异有统计学意义（F=523.60，P<0.05）。见图2，表1。

2.3 miR-122过表达对肝癌细胞凋亡率的影响

与对照组人正常肝细胞株LO2相比，miR-122过表达后，肝癌细胞株HepG2和高转移能力肝癌细胞株SMMC-7721细胞凋亡率显著升高，差异有统计学意义（F=2418，P<0.05）。见图3，表2。

2.4 miR-122靶基因预测及其过表达对细胞LAMC1 mRNA影响

检索miR-122靶基因数据库TargetScan分析发现，LAMC1与miR-122具有结合位点，这提示LAMC1是miR-122潜在的靶基因，应用荧光素酶报告载体转染试验分析可知，野生型LAMC1 mRNA含量为（1.12±0.23），miR-122过表达后LAMC1 mRNA含量为（0.61±0.37）；突变型LAMC1 mRNA含量为（1.11±0.26），miR-122过表达后LAMC1 mRNA含量为（0.94±0.43）；过表达miR-122能够直接作用于野生型LAMC1 3′UTR的特定序列，并对LAMC1起到負性调控作用，表明LAMC1是miR-122的靶基因，miR-122过表达后野生型LAMC1 mRNA含量显著降低，差异有统计学意义（t=6.41，P=0.00）。见图4、图5，表3。

2.5 miR-122过表达对肝癌细胞侵袭和迁移的影响

与对照组人正常肝细胞株LO2相比，miR-122过表达后，肝癌细胞株HepG2和高转移能力肝癌细胞株SMMC-7721细胞侵袭和迁移能力显著下降，差异有统计学意义（P<0.05）。见封三图3。

3 讨论

细胞与细胞外基质的相互作用主要是通过粘着斑与细胞外基质相连接的应力纤维而成。细胞外基质是细胞外环境的重要组成成分，通过激活细胞因子和生长因子参与调控细胞信号通路[16-18]。细胞外基质主要包括糖胺聚糖、结构蛋白和粘着蛋白，这些物质构成复杂的网架结构，支持并连接组织结构、调节组织的发生和细胞的生理活动。其中纤粘连蛋白和层粘连蛋白能够促使细胞同基质结合。其中以胶原和蛋白聚糖为基本骨架在细胞表面形成纤维网状复合物，这种复合物通过纤粘连蛋白或层粘连蛋白以及其他的连接分子直接与细胞表面受体连接，或附着到受体上。由于受体多数是膜整合蛋白，并与细胞内的骨架蛋白相连，所以细胞外基质通过膜整合蛋白将细胞外与细胞内连成了一个整体。层粘连蛋白LAMC1是一种细胞外基质的重要调节因子，广泛存在于细胞膜的基底膜带中。其生物功能是细胞黏着于基质的介质，并与多种基底膜成分结合，调节细胞生长和分化。LAMC1可通过与细胞间的相互作用直接或间接的影响细胞的活动，如细胞粘附与转移、增殖与凋亡、分化与极化等明显相关[19，20]。研究表明，层粘连蛋白-1具有增强细胞间粘附的作用，LAMC1通过与细胞间的相互作用可直接或间接控制细胞的活动，其表达可明显调控肿瘤的发生发展、癌细胞的迁移和侵袭能力。

本研究表明，肝癌细胞株HepG2和高转移能力肝癌细胞株SMMC-7721内miR-122含量显著降低，说明在肝癌细胞中miR-122呈低表达状态。上调miR-122表达后，肝癌细胞株HepG2和高转移能力肝癌细胞株SMMC-7721细胞存活率显著降低，细胞凋亡率显著升高，且在高转移能力肝癌细胞株SMMC-7721细胞的表现更为明显，说明miR-122过表达可有效抑制肝癌细胞的增殖和分化，并促进肝癌细胞的凋亡发生。同时，肝癌细胞株HepG2和高转移能力肝癌细胞株SMMC-7721过表达miR-122后，细胞内LAMC1 mRNA含量显著降低，肝癌细胞株HepG2和高转移能力肝癌细胞株SMMC-7721细胞侵袭和迁移能力显著下降，说明miR-122可对肝癌细胞内靶基因LAMC1起到负性调控作用，影响肝癌细胞的侵袭和迁移能力。

综上所述，外周血miR-214基因的异常表达可明显提示患者肺癌疾病情况；同时，肺癌细胞内过表达miR-214基因可显著调控肺癌细胞的增殖及凋亡能力，并对肺癌细胞的多药耐药能力具有一定的影响。上调miR-122表达可有效抑制肝癌细胞株HepG2和高转移能力肝癌细胞株SMMC-7721的分化增殖及凋亡能力，迁移能力和侵袭能力。且肝癌细胞内LAMC1为miR-122作用的靶基因。本研究将为临床应用miR-122基因治疗肝癌提供可靠的实验依据，但miR-122是否还可通过调控其他靶基因来共同作用，仍需进一步探究。

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（收稿日期：2018-01-02）