脐带间充质干细胞无血清培养的实验研究

[摘要] 目的 建立一种简单的体外无血清培养扩增人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs）的方法。 方法 利用酶消化法分离hUCMSCs，在无血清干细胞培养体系下培养扩增，进行形态学观察，CCK-8法分析细胞生长曲线，流式细胞仪分析细胞表面抗原表达及细胞周期，进行成骨、成脂诱导分化。 结果 hUCMSCs呈典型的成纤维细胞形态，具有较强的增殖能力。CD29、CD44、CD90、CD105均呈阳性表达，而CD34、CD45呈阴性表达。3周可诱导分化为脂肪细胞和成骨细胞。 结论 利用酶消化法和无血清的培养体系能够快速分离培养出大量hUCMSCs，该方法扩增得到的间充质细胞具备稳定的细胞标记物和生长状态，可用于各种治疗的临床试验。

[关键词] 间充质干细胞；脐带；无血清培养液；细胞培养

[中图分类号] R446.11 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2013）27-0085-03

hUCMSCs因来源丰富、体外扩增能力强、免疫原性低、无伦理问题等受到干细胞研究者的重视。无血清培养基因组分较明确，减少了异种血清临床应用的潜在危险。本实验应用无血清培养体系分离培养hUCMSCs，解决其临床应用的生物安全性问题。

1 材料与方法

1.1 实验材料

间充质干细胞无血清条件培养基（杭州百通）、0.25%胰酶（吉诺生物），Ⅰ型胶原酶（Sigma），anti-CD29、anti-CD45、anti-CD90、anti-CD105 （BD Biosciences），anti-CD34（Santa Cruz Biotechnology），anti-CD44（Abcam），细胞周期即时检测试剂盒（凯基生物），成骨及成脂诱导分化培养液、茜素红、油红O （Cyagen）。脐带取自剖腹产足月胎儿，由解放军117医院妇产科提供，产妇及家属对实验均知情同意，并经医院伦理委员会批准。

1.2 实验方法

1.2.1 hUCMSCs的分离培养及传代 无菌PBS漂洗新生儿脐带，剪成3 cm的小段，剥离血管，用PBS洗涤干净，剪碎后放入离心管中。加入10 mL 0.2%Ⅰ型胶原酶及5 mL PBS置于37℃孵箱中消化过夜。加入10 mL 0.25%胰酶-0.02%EDTA，37℃消化45min后，200目滤网过滤掉较大团块，用PBS充分稀释，反复混匀后分装入离心管中，室温3 000 rmp离心20 min。弃上清，加入适量培养基混匀。细胞计数，接种密度为106个/cm2，置于37℃、饱和湿度、5%CO2孵箱中培养。3～5 d后换液，洗去悬浮的组织和细胞。待细胞生长至80%融合时，PBS清洗2次，加入1 mL预热的0.05%胰酶，待显微镜下细胞变圆后，用旧培养液终止消化，轻轻吹打，吸取细胞悬液于离心管中，室温300 g离心10 min。收集细胞，并计数，以5×103/cm2的接种密度进行传代。

1.2.2 CCK-8法检测细胞活性 取生长状态良好的第3代细胞，调整细胞浓度至2×107/L加入96孔板，每孔100 μL，放在37℃、5% CO2的培养箱中培养，7d内在特定时间点，取出96孔细胞培养板每孔分别加入10 μL CCK-8溶液，继续孵育1 h。用酶标仪（波长450 nm）测定各孔吸光度值（OD值），以OD值代表细胞的相对数量，绘制细胞生长曲线。

1.2.3 流式细胞仪检测细胞周期 取对数生长期的细胞，常规消化，1500r/min离心5min，取细胞悬液100 μL（含有2×105个细胞）。加入200 μL预冷乙醇固定，室温孵育10 min，加入RnaseA 200 μL，尽量避免产生气泡，室温孵育10 min，加入碘化丙啶300 μL，室温避光孵育15 min，上机检测。

1.2.4 流式细胞仪检测细胞表面抗原 取生长状态良好的细胞，消化并计数，以每管含1×106个细胞，分别加入10 μL单克隆抗体CD29、CD34、CD44、CD45、CD90及CD105，同型对照10 μL作为阴性对照，室温避光孵育30 min，PBS洗涤2次，室温300 g离心5 min，PBS重悬后，上流式细胞仪检测。

1.2.5 成脂、成骨诱导分化 待第3代细胞达80%融合，常规消化，以5×104/孔密度接种于6孔培养板（成骨诱导培养皿底部包被明胶），常规培养，待细胞达80%融合时，成脂、成骨诱导组分别加入2 mL成脂、成骨诱导分化液，对照组加入等量基础培养液，一周换液2～3次，倒置显微镜下观察细胞形态与生长情况，3周后分别进行油红O、茜素红染色。

2 结果

2.1细胞基本生物学特征

酶消化法获得的细胞4d后有大量细胞贴壁，部分细胞伸出伪足，形态不一，见封三图4A。经过约8d培养后细胞汇合成片，呈均一的成纤维细胞形态。传代后细胞较快贴壁伸展，增殖较快，培养3d细胞可达80%融合，见封三图4B。CCK-8法检测细胞生长曲线呈S型，细胞接种后1～2 d为适应期，第2～5天为快速增长期，随后进入平台期，符合正常细胞的生长特性，见图1。

2.2 细胞生长周期

流式细胞仪检测结果显示，第3代hUCMSCs中G0/G1期细胞为78.87%，G2期细胞为3.96%，S期细胞为5.46%，见图2。

2.3 hUCMSCs表面标记物的表达

流式细胞仪检测结果显示，细胞CD29、CD44、CD90、CD105阳性率分别为99.9%、96.4%、98.5%、94.1%，而CD34、CD45阳性率分别为0.262%、0.125%，验证此细胞为间充质干细胞，而非造血干细胞来源，纯度较高，见图3。

2.4 成脂、成骨诱导分化鉴定

成脂诱导组细胞形态逐渐由梭形变为圆形，3周后有成串的脂滴形成，油红O染色后呈现橙红色，见封三图5A。成骨诱导组细胞外基质分泌逐渐增多，3周后运用茜素红进行钙化结节染色，可见大量橘红色致密结节形成，见封三图5B。对照组染色均未见阳性结果。

3 讨论

目前基础与临床研究中应用的间充质干细胞主要来源于成人骨髓，但在衰老和疾病情况下其数量和扩增、分化能力显著下降，取材过程会给患者带来创伤，面临医学伦理学的困扰，使其在临床应用受到一定限制。脐带是孕妇与胎儿之间的物质交通支，是分娩后的废弃物，来源丰富，收集脐带对产妇和胎儿均不造成伤害。与骨髓MSCs相比，hUCMSCs增殖潜能、活性更高，免疫原性相对较低[1]。Ma等[2]研究发现人脐带沃顿胶中的MSCs不表达移植物抗宿主病相关的抗原MHC-II，在免疫抑制治疗方面具有积极的临床应用前景[3]，有望代替骨髓干细胞成为一种新的MSCs来源。

已有多篇文献报道成功分离培养UCMSCs[4]，但培养体系中加入了一定比例的血清如胎牛血清、脐血血清、正常人的AB血清等。血清含丰富的营养成分、细胞因子、微量元素以及贴壁因子等，有利于细胞的生长。添加胎牛血清的培养基被认为是体外扩增MSCs最有效的培养基。但是，血清中的成分尚不明确，可能携带病原体、异种蛋白抗原，在生产临床级别的细胞产品时，理论上会导致病原体的传播及临床排斥反应。基于能够提供应用于临床的MSCs为目标，本实验选择了无血清的MSCs专用培养基培养体系，避免以往使用任何人与动物血清培养体系，为MSCs临床应用安全性、有效性的标准化提供有益的依据。

目前分离hUCMSCs主要有组织块贴壁法[5]及酶消化法[6]两种。前一种方法费时较长，很难彻底分离脐带组织中的干细胞，传代后纯化时间长，很难短时间内获得大量种子细胞满足临床细胞移植的需要。采用胶原酶消化法可快速获得大量贴壁生长的原代细胞，操作简便易行，冻存复苏后免疫表型无显著变化，保持较好的细胞活力[7]。吴伟等[8]利用化学成分明确的无血清培养基在体外培养扩增骨髓MSCs，可以维持干细胞特性，用于细胞治疗以及生物医学研究。方彦艳等[9]利用无血清的人MSCs专用培养基培养体系，脐带组织培养法能够分离培养出大量MSCs，避免了培养中异种蛋白的混入而降低临床排异反应。

应用该培养体系，hUCMSCs传代后3d就可达到80%～90%融合，CCK-8法检测细胞增殖率发现，细胞体外扩增和自我更新能力很强。流式细胞术分析显示无血清培养条件下78%细胞处于细胞周期的G0/G1期，符合干细胞的慢周期特性。体外培养的细胞经流式细胞仪检测均一性好，CD29、CD44、CD90、CD105均呈强阳性表达，但不表达CD34（造血前体细胞表面标志） 和CD45（白细胞抗原），证明此细胞非造血干细胞来源。经成骨、成脂诱导液体外培养后，hUCMSCs具有良好的成骨、成脂分化能力。细胞贴壁能力很强，呈漩涡状的集落形态特征，具有强大的增殖能力。以上特征与Bruyn等[10]报道的结果一致，符合国际细胞治疗委员会规定的间充质干细胞的三条鉴定标准。研究表明，应用无血清培养基体系酶消化法可快速获得足够应用于临床治疗级细胞数量，为下一步体外定向诱导hUCMSCs向肝样细胞分化，为肝组织工程提供种子细胞来源。

[参考文献]

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[9] 方彦艳，马健. 血清培养基分离培养脐带间充质干细胞的研究[J].同济大学学报（医学版），2010，31（5）：21-24.

[10] Bruyn CD，Najar M，Raicevic G，et al. A rapid，simple，and reproducible method for the isolation of mesenchymal stromal cells from Wharton’s jelly without enzymatic treatment[J]. Stem Cells Dev，2011，20（3）：547-557.

（收稿日期：2013-07-25）