毛细管区带电泳测定D1蛋白酶的活性及其抑制剂先导化合物的筛选

摘 要 建立了毛细管区带电泳技术快速测定D1蛋白酶活性及其抑制剂先导化合物的筛选方法。实验选用未涂层熔融石英毛细管（43 cm 和磷酸盐缓冲溶液（50 mmol/L, pH 3.0）作为分离介质，运行电压18 kV，测定了D1蛋白酶的活性并对部分抑制剂先导化合物进行了筛选。结果表明, ITP26和ITP21两种异GFDA1唑噻唑哌啶类先导化合物对蛋白酶活性具有抑制作用，抑制率分别为26%和13%。

关键词 D1蛋白酶； 毛细管区带电泳； 活性； 先导化合物

1 引 言

D1蛋白酶（D1 C-terminal processing protease, CtpA）是由叶绿体核ctpA基因编码、含有389个氨基酸残基的单亚基蛋白，分子量约为45 kDa，广泛存在于各种生物体中[1]。其作用主要是通过剪切D1蛋白前体C端延伸的肽段，促使其转化成具有活性的D1蛋白，用于光合系统II中锰簇复合物的组装，是植物进行光合作用所必须的步骤，因此D1蛋白酶被认为是一种新型优异的广谱除草剂作用靶标[2]。

开发以D1蛋白酶为靶标的新型农药，首先需要获得具有生物活性的重组蛋白酶和选择合适的先导化合物抑制活性筛选方法。D1蛋白酶活性检测通常采用两种方法：一是采用前体蛋白作为反应底物，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE） 迁移检测反应产物[3]；二是以合成的D1 前体蛋白剪切位点附近的肽段作为反应底物，剪切后的肽段采用高效液相色谱（HPLC）进行分离和检测[4]。前者凝胶迁移法准确度较低，不适合大规模操作；后者的准确度较高，但由于采用高效液相色谱法，分析过程耗时较多，也不适合快速和高通量筛选的要求。毛细管电泳（CE）具有灵敏度高、环境污染少、进样量小、样品不需前处理、操作简单等优点，在生物工程、药物分析和检测等领域获得了广泛应用，可用于多肽分离和蛋白质的分析[5～7]。本研究采用毛细管区带电泳建立了重组D1蛋白酶生物活性的测定方法，并用于抑制剂先导化合物筛选。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂P/ACE MDQ 型毛细管电泳仪（美国Beckman-Coulter公司）；熔融石英毛细管柱（河北永年锐沣色谱器件公司，50 cm 有效长度43 cm）；KTA purifier 100 蛋白纯化系统（GE Healthcare, 美国）。9肽（9P, AIEAPSTNG）、24肽（24P, VMHE RNAHNFPLDLAAIEAPSTNG）均由上海吉尔生化公司合成；异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG，北京鼎国生物技术有限公司）；其它试剂均为国产分析纯。

2.2 实验方法

2.2.1重组蛋白酶的表达和纯化 D1蛋白酶的表达和纯化参照文献 [8]的方法，将纯化得到的蛋白溶液超滤浓缩，采用HiTrap脱盐柱除去咪唑，进行SDS-PAGE电泳鉴定和分析。

2.2.2 毛细管电泳分离条件的选择 毛细管电泳分离选用磷酸盐缓冲液，以未涂层的石英毛细管为分离柱（有效长度43 cm，内径75 上清液进行毛细管电泳分析，以多肽峰面积确定酶活性大小。进行抑制剂先导化合物的筛选时，酶溶液和待测化合物（DMSO溶解）混合后首先在25 ℃恒温水浴中放置30 min，使二者充分结合，然后进行酶活性的测定。分别以缓冲液和DMSO代替化合物溶液作为阴性对照和阳性对照，根据24肽吸收峰面积的变化计算抑制率。

3 结果与分析

3.1 D1蛋白酶的表达和纯化

为了获得具有较高生物活性的重组D1蛋白酶，对表达条件进行优化，通过选择降低诱导剂的使用浓度和诱导温度，获得了可溶性表达的重组蛋白酶。采用亲和层析法纯化得到的蛋白酶纯度可达到95%以上（图1），比活力为1.10

为文献[9]的15倍，可用于毛细管电泳分析。

3.2 电泳分离条件的优化

3.2.1 缓冲液pH值对分离的影响 运行缓冲液pH值在2～10范围内对多肽保留时间影响的结果如图2所示。在pH值6～8范围内，两种多肽达不到完全分离的要求。将pH值提高至9～10时，化合物的保留时间有所差别，但差别较小。而将pH值降低至2～5后，两种小肽的分离度增大。其原因是高pH值条件下, 毛细管柱内壁表面的硅羟基发生电离, 其表面负电荷密度增加, 导致电渗流增大，缩短了待测物的出峰时间。随着pH值的降低, 硅羟基的电离受到抑制, 电渗流也相应降低。当pH＜3后, 质子化作用使得电渗流趋于零, 此时pH值的改变对电渗流的影响较小[10]。本实验确定最适pH值为3。

3.2.2 缓冲液浓度对分离的影响 缓冲液浓度为20和30 mmol/L时，两种多肽的迁移时间较短，分离度较低，峰形较宽（见图3）。浓度增大至50 mmol/L时，多肽的迁移时间增大，但谱峰变得较为尖锐，分离度也相应提高。其原因在于增大缓冲液浓度后, 溶液的离子强度增加，毛细管内壁的双电层压缩，减小了电渗流, 待测物的迁移速度降低, 迁移时间增加。 增大缓冲液的浓度可以减弱样品之间以及样品与毛细管壁间的相互作用, 从而减少谱带变宽, 提高分离效率[11]。但当浓度进一步增大到高于50 mmol/L时，会导致焦耳热升高，反而使得谱带变宽，并产生一些杂峰。本实验中缓冲液浓度选择为50 mmol/L。[TS（] 图3 运行缓冲液浓度对多肽分离度的影响

3.2.3 分离电压和进样时间的选择 实验结果表明，随着分离电压的升高，电渗流增大，样品迁移时间缩短。运行电压继续增大后，过量的焦耳热不能有效散发，从而形成径向温度梯度[12]，使得基线噪音增大，出现过多的干扰峰，导致分离度降低。但采用较小的分离电压，不仅使得分离时间延长，也会降低分离度。因此确定的最佳分离电压为18 kV。此外，如果进样时间较短，样品的峰面积较小，重现性也较差，会产生较大的分析误差；延长进样时间，虽然可以增加检测的灵敏度，但由于样品超载，造成进样区带扩展，从而导致样品峰出现变宽、拖尾等现象。最终确定最佳进样时间为10 s。

3.3 D1蛋白酶活性的测定及其抑制剂先导化合物的筛选

以合成的D1前体蛋白羧基端延伸的24肽作为模拟底物，采用毛细管电泳法测定了D1蛋白酶的生物活性，所得结果如图4所示。蛋白酶水解24肽后生成相应的9肽和15肽，反应后24肽对应的吸收峰高明显降低，同时在17.7 min处出现一个新的吸收峰，经过对照确认为9肽。此外，在16 min位置还出现了一个小的吸收峰，推测可能为生成的15肽。根据24肽反应前后吸收峰面积的变化可知其被水解了43%，与高效液相色谱法测定的活性较为接近。

从图4可见，在反应体系中加入蛋白酶后，24肽和9肽的迁移时间以及两者的间隔明显增大，吸收峰也变宽。其原因在于加入高浓度的蛋白质分子后，蛋白质与毛细管壁产生吸附效应，使电泳区带增宽，导致吸收峰的拖尾和变形。此外，高浓度蛋白质的加入还改变了缓冲液的粘度以及与毛细管壁发生了作用[13]，影响了电渗流，从而导致24肽与9肽的迁移时间增大和吸收峰变宽。

抑制剂先导化合物对D1蛋白酶抑制活性的测定结果如图5所示。由于先导化合物的溶解性较差，仅溶于二甲亚砜（DMSO），考察了DMSO对D1蛋白酶活性的影响。从图5可见，少量 DMSO的加入对蛋白酶的活性影响很小，因此可以忽略溶剂对酶活性测定的影响。当蛋白酶与先导化合物ITP21作用后，发现其具有较明显的抑制作用，24肽对应的吸收峰较未加入化合物体系的24肽吸收增高，而9肽和15肽对应的吸收峰消失，证实了毛细管电泳法对先导化合物抑制活性进行测定的可行性。

分别测定了19个先导化合物对D1蛋白酶的抑制活性，结果表明，两种异噁唑噻唑哌啶类先导化合物ITP21和ITP26对D1蛋白酶具有一定程度的抑制作用，其抑制率分别为21%和13%，其它先导化合物对蛋白酶的抑制活性不明显。本方法简便、快速、灵敏度高，可用于D1蛋白酶抑制剂先导化合物筛选。

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Abstract Capillary zone electrophoresis （CZE） with UV detection has been used for the determination of D1 protease activity and screening for lead compounds of inhibitor. Separation conditions of peptides were optimized as phosphate buffer （50 mmol/L, pH 3.0） at 18 kV running voltage, with capillary length of 43 cm