黏膜免疫佐剂的筛选Ⅱ.ELISA检测

材料与方法

1.1 材料

1日龄SPF雏鸡80只，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心SPF动物室提供。

酶标反应板、ELISA检测仪、5～50μL八道微量移液器。

霍乱毒素B亚单位购于Sigma公司，白细胞介素-2和蜂胶由本校产科教研室提供，左旋咪唑和明矾购于北京化学试剂公司（分析纯）。鸡新城疫标准抗原由本校微生物教研室提供，新城疫V4（NDV4）弱毒苗由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所生产，鸡新城疫强毒由哈尔滨兽医研究所禽病室提供（F4 819，LD50=1 000）、H2O2、DAB、H2SO4、pH 7.4 PBST、pH 9.6碳酸缓冲液。

SP-9001型试剂盒（正常山羊血清工作液、生物素标记羊抗兔IgG工作液、辣根过氧化物酶标记链霉卵白素工作液），兔抗鸡IgA、兔抗鸡IgG、兔抗鸡IgM由东北农业大学动物医学系提供。

1.2 方法

1日龄SPF雏鸡80只随机平均分为8组，即CT-B佐剂组、左旋咪唑佐剂组、白细胞介素佐剂（1 000 IU/只）组、白细胞介素佐剂（100 IU）组、明矾佐剂组、蜂胶佐剂组、普通免疫组和非免疫组。14日龄点眼免疫。29日龄采取血清学材料后进行攻毒试验。

23日龄时，对各组雏鸡进行翅下采血0.5～1.0 mL，保存于1.5 mL的微型离心管内，室温静置12 h或在37 ℃恒箱内30 min析出血清，对没有析出血清的标本可进行离心提取。用氨水刺激的方法收集泪液[1]。

ELISA检测用间接ELISA法[2]。各组ELISA检测值多元统计分析检验。

在哈尔滨兽医研究所实验动物中心禽病感染室做攻毒试验。攻毒剂量为1 mL（原毒液1 000倍稀释）。

2 结果与分析

2.1 ELISA检测

由表1可知，CT-B组泪液中IgA、IgG、IgM均高于其他各组，差异显著（P<0.05）。由表2可知，CT-B组血液中IgA、IgG、IgM均高于其他各组，差异极显著（P<0.01）。

2.2 新城疫强毒攻击试验

30日龄时，用新城疫强毒攻击后3天，非免疫组SPF雏鸡开始发生死亡，经5天非免疫组雏鸡全部死亡。普通免疫组死亡1只。

3 小结

根据实验各组雏鸡血清、泪液的ELISA检测结果，霍乱毒素B亚单位佐剂新城疫疫苗使雏鸡外分泌产生的IgA最多，与其他组的差异显著（P<0.05）；血清中抗体含量较高，差异极显著（P<0.01）。这表明CT具有很强的黏膜佐剂作用，能诱导强烈的黏膜和系统免疫。但CT的黏膜佐剂机制以及CT与口服耐受的关系等有待于进一步的实验研究来阐明。随着微生物学、免疫学和分子生物学技术的发展，可以成为动物黏膜免疫的重要佐剂，从而将具有良好的研究应用价值[3，4]。

CT的强毒性使其应用受限。作为未来的黏膜免疫佐剂，应该是无毒副作用、高效且广谱。CTB在一些试验中虽取得一定的效果，但其结果却高度不一致，这可能与其较差的稳定性有关，其可以被恶劣的肠道环境所降解，因此B亚基经口给药时不是一种很有效的佐剂。而A亚基的存在，包括其无毒突变体都可以增强CTB五聚物的稳定性。所以当前CT的研究主要是构建减毒突变体及嵌合体，目的是使其保持一定的酶活性而获得足够的佐剂活性，同时酶活性又不至于对动物体产生明显的毒副作用[4，5]。

参考文献：

[1] 孙 斌，高齐瑜，王彩虹.鸡结膜结合淋巴组织（CALT）对新城疫疫苗点眼的免疫应答[J].畜牧兽医学报，1997，28（3）：245-250.

[2] 黄金海，刘业兵，丁伯良，等.间接ELISA法检测鸡新城疫抗体[J].中国兽药杂志，2005，39（6）：22-26.

[3] 范春玲，孙斌，任凤兰.黏膜免疫佐剂的筛选I.组织学与免疫组织化学研究[J].中国兽医杂志，2008，44（7）：27-28.

[4] 任学毅，金勇丰，朱成钢，等.霍乱毒素B亚单位的研究进展[J].中国药学杂志，2003，38（12）：897-900.

[5] 郝海霞，李润花，殷国荣.霍乱毒素作为黏膜佐剂的研究进展[J].中国病原生物学杂志，2012，7（1）：70-74.