家蝇肠道益生菌胞外多糖抗氧化活性研究

摘要：从家蝇（Musca domestica）体内筛选出两株高产胞外多糖的芽孢杆菌，分别命名为芽孢杆菌xzf1（Bacillus sp.）、芽孢杆菌xzf2（Bacillus sp.）。经多糖分离纯化，芽孢杆菌xzf1产胞外多糖（Extracellular polysaccharides，EPS）BEPS11、BEPS12，芽孢杆菌xzf2产胞外多糖BEPS21、BEPS22、BEPS23。分别检测其清除1，1-二苯基-2-苦基肼（DPPH）自由基、羟自由基、超氧自由基的能力。结果表明，胞外多糖具有很强的清除活性氧自由基的能力，在较低浓度下很多多糖的清除能力都高于维生素C，是一种良好的天然抗氧化剂。该研究可为益生菌胞外多糖应用于实际生产提供一定的理论和方法依据。

关键词：肠道益生菌；胞外多糖；活性氧自由基；抗氧化活性；家蝇（Musca domestica）

中图分类号：Q936 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）19-4740-04

多糖在自然界高等植物、藻类、细菌及动物体内均存在，分布极广。近年来，微生物来源的多糖越来越引起人们的广泛注意[1]。多糖是由多个单糖或单糖衍生物聚合而形成的大分子生物有机物质[2]，是具有生物活性的复杂极性大分子，分子质量比较大，与核酸、蛋白质、脂类并称为构成生命活动的四大基本物质，与维持生命所需的多种生理功能密切相关[3]。微生物胞外多糖是细菌、蓝藻和真菌等微生物在生长代谢过程中产生的对其自身有保护作用的生物高聚物[4-6]，细菌胞外多糖在食品领域、医药领域、石油工业等领域已具有广泛的应用，尤其是细菌胞外多糖因具有抗感染、抗病毒、抗辐射、抗血栓和免疫调节及抑制肿瘤细胞活性等作用而引起重视[7，8]。

家蝇（Musca domestica）属昆虫纲双翅目环裂亚目蝇科，是中国大部分地区最常见、数量最多的一种蝇类。由于其生活环境复杂、食物来源恶劣，家蝇的生存能力除与自身体内存在大量抗菌活性物质有关外，与肠道内益生菌也有很大的关系。本研究旨在从家蝇肠道中筛选出产活性物质的益生菌，为活性多糖的筛选另辟一条思路，以获得更多有用的活性物质。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

试剂：1，1-二苯基-2-苦基肼（DPPH）购于Sigma公司，DEAE-Cellulose 52离子交换柱和Sephadex G-1000等试剂均为国产分析纯级。

仪器：UV2550型紫外可见分光光度计（日本岛津公司），SY-305B发酵罐（上海世远生物设备工程有限公司），旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），YXQ-LS-50G立式压力蒸汽灭菌器（上海博迅实验有限公司医疗设备厂），MA99-2A自动核酸蛋白分离层析仪（上海沪西分析仪器有限公司），Scientz-10N型冷冻干燥机（宁波新芝生物科技有限公司）。

1.2 培养基

LB固体培养基[9]。

1.3 家蝇肠道产多糖菌的筛选

2011年10月在实验室内捕获活力很强的家蝇1只，立即将其浸入75%乙醇中进行体表消毒灭菌1 min，在无菌环境下利用灭菌研钵和石英砂磨碎，加入1 mL无菌生理盐水溶解，随后将其稀释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5系列梯度，均匀涂布于LB固体培养基表面，每梯度重复10次，在37 ℃倒置培养24 h后，选取黏稠、不易挑取的单克隆菌落划线接种于试管斜面上，4 ℃保存备用。

1.4 菌种鉴定

从菌落形态和菌体显微形态结构观察鉴定菌属[10]。

1.5 菌种培养

1.6 多糖提取

发酵液经12 000 r/min离心，合并上清液，于50 ℃用旋转蒸发仪浓缩至200 mL， 加入4倍于浓缩液的无水乙醇进行充分搅拌，放入冰箱中低温静置24 h，将沉降物采用差速离心法逐级沉淀获得两种粗多糖沉淀，将分离后的多糖在真空冷冻机中干燥至粉末状。

1.7 多糖纯化

将上述得到的粗多糖使用DEAE-Cellulose 52离子交换柱分离纯化，利用苯酚硫酸法检测多糖含量，并将其中含量较高的成分收集起来，利用Sephadex G-1000进行分离纯化，苯酚硫酸法和核酸蛋白仪跟踪检测获得组分，冷冻干燥备用[12]。

1.8 多糖抗氧化活性的研究

1.8.2 超氧自由基的清除[14-19] 应用邻苯三酚自氧化体外模拟化学反应，将1 mL 3 mmol/L的邻苯三酚加入到含不同浓度多糖溶液的pH 8.2 Tris-HCl缓冲液中，在两液混合后10 min内每隔30 s测其在325 nm处的吸光值。以不加多糖的反应液为对照计算多糖对O2-的清除率。维生素C也以同样方法测定其清除率。清除率的计算公式如下：

清除率=[（k0-k1）/k0]×100%，式中，k0为邻苯三酚自氧化速率，即自氧化曲线的斜率；k1为加入不同浓度多糖后氧化曲线的斜率。

1.8.3 羟自由基的清除[16-19] 采用H2O2/Fe2+体系，通过Fenton反应生成羟自由基，在体系内加入水杨酸捕捉羟自由基并产生有色物质，该物质在波长510 nm处有最大吸光值。取不同浓度的多糖溶液和维生素C各1 mL于试管中，分别加入9 mmol/L的FeSO4 1 mL、9 mmol/L的水杨酸乙醇溶液1 mL，最后加入9.8 mmol/L的H2O2 1 mL启动整个反应。反应体系在37 ℃的水浴锅中反应50 min，然后在510 nm处测定其吸光值Ai，用水代替H2O2用上述同样方法测定吸光值Aj，用水代替多糖溶液（空白对照）用上述同样方法测定吸光值Ac。维生素C也以相同方法测定其清除率。清除率的计算公式如下：清除率=[1-（Ai-Aj）/Ac]×100%。

2 结果与分析

2.1 菌种及形态学特征

通过菌落形态及显微观察，初步判定所筛选出的两株细菌属芽孢杆菌属（Bacillus），分别命名为芽孢杆菌xzf1（Bacillus sp.）、芽孢杆菌xzf2 （Bacillus sp.），其菌落形态及显微染色形态见图1、图2、图3、图4。两株菌落皆不透明，乳白色，菌落突起皱褶，边缘不整齐；不易挑起，黏稠拉丝状，有霉菌抑菌圈。显微观察发现菌体呈杆状，芽孢近圆形，有些芽孢正萌发。经《伯杰细菌鉴定手册》初步鉴定为芽孢杆菌属（Bacillus），而且应为产胞外多糖芽孢杆菌，经荚膜染色证实了这一点。

2.2 多糖的分离纯化结果

两株细菌扩大发酵培养后，培养液经浓缩后加4倍体积无水乙醇，首先采用差速离心法初步分离多糖，经冷冻干燥得粗多糖。芽孢杆菌xzf1发酵液提取获得2种粗多糖，即BEPS11、BEPS12，其中BEPS11先被离心下来，为白色离散粗颗粒状；BEPS12后被离心下来，为红色黏稠状。芽孢杆菌xzf2得3种粗多糖，即BEPS21、BEPS22、BEPS23，其中BEPS21先被离心下来，为白色颗粒状；随后得到BEPS22，为黄色颗粒状；最后得到BEPS23，为浅棕色黏稠状。经去蛋白脱色，再经柱层析纯化，280 nm处没有出现吸收峰，收集到的每管均检测其含糖量，每种粗多糖只出现一个峰，表明获得的5种多糖均为纯品。

2.3 对DPPH自由基的清除作用

由图5、图6可知，5种多糖对DPPH自由基均有一定的清除作用，芽孢杆菌xzf1所产的BEPS11和 BEPS12在浓度为15 μg/mL时其清除率分别达到37.46%和34.58%，都高于维生素C一半的清除率。芽孢杆菌xzf2所产BEPS23在浓度为45 μg/mL时清除率为65.89%，高于维生素C，BEPS22、BEPS21在浓度为15 μg/mL时其清除率分别为34.58%和47.16%。由此可见，5种多糖对DPPH自由基均具有显著的清除作用。

2.4 对超氧自由基的清除作用

由图7、图8可以看出，5种多糖对超氧自由基均有一定的清除作用。芽孢杆菌xzf1所产的BEPS11的清除率在30 μg/mL以下均高于维生素C，最高达到23.59%；BEPS12在浓度为30 μg/mL时其清除率达到14.68%。芽孢杆菌xzf2所产的3种多糖在15 μg/mL时其清除率均高于维生素C。BEPS21在浓度为45 μg/mL时其清除率为38.05%，高于维生素C；BEPS22在浓度为90 μg/mL时其清除率为49.95%；BEPS23在浓度为15 μg/mL时其清除率为33.63%。由此可见，5种多糖均能明显降低邻苯三酚发生自氧化的速率，即对超氧自由基有显著的清除能力。

2.5 对羟自由基的清除作用

由图9、图10可见，5种多糖对羟自由基均有一定的清除作用。芽孢杆菌xzf1所产的BEPS11在浓度为75 μg/mL以下时其清除率均高于维生素C，在45 μg/mL时最高，达42.80%；BEPS12在浓度为75 μg/mL时其清除率最高，达31.70%。芽孢杆菌xzf2所产3种多糖在浓度为60 μg/mL以下时其清除率均高于维生素C，3种多糖清除率均随多糖浓度升高而增大，在90 μg/mL时达到最高，分别为31.81%、34.08%、34.76%。

3 小结与讨论

本试验从家蝇体内筛选获得两株芽孢杆菌，从菌落形态观察得知两株细菌产多糖较高。多糖在各领域应用价值很高，因而本试验对两株细菌所产的5种多糖的分离纯化和抗氧化性进行了研究。研究结果表明，经简单差速离心获得粗多糖，再通过层析纯化和多糖含量检测，所得多糖皆为纯品，表明分步离心方法是一种分离多糖的简单有效方法。

对5种多糖抗氧化性的研究结果表明，多糖具有显著清除DPPH自由基、羟自由基和超氧自由基的能力。在较低浓度下，很多多糖的清除率高于维生素C，其中，BEPS23在浓度为45 μg/mL时对DPPH自由基的清除率为65.89%；BEPS22在浓度为90 μg/mL时对超氧自由基的清除率为49.95%；BEPS11在浓度为45 μg/mL时对羟自由基的清除率为42.80%。可见5种多糖均具有很强的抗氧化性，有一定的开发和应用潜力。本试验结果为抗氧化性多糖的进一步研究和开发利用奠定了一定的理论基础。

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