人参对感染后小鼠肠黏膜的干预效果及对血清CRP、TNF-α、IL-6水平的影响

[摘要] 目的 探讨人参对感染后小鼠肠黏膜的干预效果及对血清C反应蛋白（CRP）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）水平的影响。 方法 60只小鼠中，随机抽取15只为空白对照组，剩余45只用于制备重症腹腔感染模型（感染组）。然后再将45只小鼠模型采用隨机数字表法分为三组：模型组、抗炎组、抗炎+人参组，每组各15只。抗炎组给予亚胺培南/西司他丁333.33 mg/kg（腹腔注射，12 h/次），抗炎+人参组在抗炎组的基础上给予人参皂苷Rb1（纯度98%以上）50 mg/（kg·d）灌胃，模型组给予等量无菌生理盐水腹腔注射。分别于治疗后24、48、72 h取血标本，每组每次5只，观察各组小鼠肠黏膜CRP、TNF-α、IL-6水平变化情况;留取末端回肠，行HE染色，观察肠黏膜层情况，并计算肠黏膜上皮细胞凋亡指数。 结果 重症腹腔感染后，小鼠肠黏膜出现萎缩，肠黏膜上皮细胞凋亡数目明显增多，且肠黏膜萎缩程度越明显，肠黏膜上皮细胞凋亡数目越多。治疗后72 h，抗炎+人参组重症腹腔感染小鼠的CRP、TNF-α、IL-6水平显著降低（P < 0.05或P < 0.01），且下降幅度大于抗炎组（P < 0.05）;抗炎+人参组细胞凋亡指数显著低于模型组和抗炎组（P < 0.05或P < 0.01）。 结论 重症腹腔感染可导致肠黏膜萎缩，肠黏膜萎缩与肠黏膜上皮细胞凋亡数目有关;人参对肠黏膜有保护作用，其能改善肠黏膜萎缩的症状，减少对肠黏膜分泌物的影响。

[关键词] 腹腔感染;肠黏膜;人参;细胞凋亡

[中图分类号] R656          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）02（a）-0018-04

[Abstract] Objective To investigate the effects of ginseng on intestinal mucosa and the levels of serum C-reactive protein （CRP）， tumor necrosis factor-α （TNF-α） and interleukin-6 （IL-6） in mice after infection. Methods Among 60 mice， 15 mice were randomly selected as blank control group， and the remaining 45 mice were used to prepare severe abdominal infection model （infected group）. Then 45 mice models were divided into three groups by the random number table method： model group， anti-inflammatory group， anti-inflammatory + ginseng group， with 15 mice in each group. The anti-inflammatory group was given Imipenem/Cilastatin 333.33 mg/kg （intraperitoneal injection， once 12 h）; the anti-inflammatory + ginseng group was given intragastric administration of ginsenoside Rb1 （purity>98%） 50 mg/（kg·d） on the basis of the anti-inflammatory group; the model group was given the same amount of sterile saline by intraperitoneal injection. Blood samples were taken at 24， 48 h and 72 h after treatment. Five rats in each group were used to observe the changes of CRP， TNF-α and IL-6 levels in the intestinal mucosa of mice in each group; the terminal ileum was harvested and HE staining was performed. The intestinal mucosal layer was observed and the intestinal epithelial cell apoptosis index was calculated. Results After severe intraperitoneal infection， mice intestinal mucosal atrophied， intestinal epithelial cell apoptosis increased significantly， and the more obvious the intestinal mucosal atrophied， the greater the number of intestinal mucosal epithelial cell apoptosis was. After treatment for 72 h， the levels of CRP， TNF-α and IL-6 in mice with severe intraperitoneal infection of anti-inflammatory + ginseng group were significantly decreased （P < 0.05 or P < 0.01）， and the decrease range was greater than that of anti-inflammatory group （P < 0.05）; the apoptotic index of anti-inflammatory + ginseng group was significantly lower than that of the model group and the anti-inflammatory group （P < 0.05 or P < 0.01）. Conclusion Severe abdominal infection can cause intestinal mucosal atrophy， intestinal mucosal atrophy is related to the number of intestinal epithelial cell apoptosis; ginseng has a protective effect on the intestinal mucosa， which can improve the symptoms of intestinal mucosal atrophy， reduce the impact on intestinal mucosal secretions.

[Key words] Intraperitoneal infection; Intestinal mucosa; Ginseng; Cell apoptosis

临床发现腹腔感染较重或者腹腔感染病史较长的患兒，会出现腹胀、腹泻等消化不良表现。这可能是因为重症腹腔感染时，肠黏膜萎缩，肠黏膜上皮细胞大量凋亡，同时肠黏膜内分泌功能受到影响，导致了肠功能紊乱[1-2]。研究表明，人参制剂及其有效成分对肠黏膜具有一定的保护作用[3]，但其机制尚不明确，为此本研究拟从腹腔感染动物模型中，探寻出肠黏膜上皮细胞凋亡与肠黏膜萎缩的关系，以及人参对肠黏膜保护的影响。现报道如下：

1 材料与方法

1.1 实验动物

6～8周龄雄性C57BL/6小鼠60只，平均体重（20.3±0.5）g，合格证号：SCXK（鄂）2015-0018，由湖北省动物实验研究中心提供，动物饲养和处理严格按照美国国立卫生研究院实验动物饲养和使用指南。

1.2 仪器与试剂

光学显微镜[Axio Imager A2m，卡尔蔡司（上海）管理有限公司];Olympus CX31显微镜;低温高速离心机[德国Eppendorf（R430型）];全自动生化分析系统（贝克曼库尔特AU480，试剂盒为上海康朗生物科技有限公司产品）;普通冰箱（海尔）;Laica HZ1210石蜡切片机（德国）;电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）;DS-425电子秤（上海寺冈电子有限公司）。

1.3 实验方法及分组

60只雄性C57BL/6小鼠采用随机分组方式抽取15只为空白对照组，另外45只用于重症腹腔感染动物模型制备（感染组）。然后再将45只小鼠模型采用随机数字表法随机分为三组：模型组、抗炎组、抗炎+人参组，每组各15只。模型制备后予以治疗干预。抗炎组给予亚胺培南/西司他丁333.33 mg/kg，腹腔注射，12 h/次;抗炎+人参组在抗生素的基础上，给予人参皂苷Rb1（纯度98%以上）50 mg/（kg·d）灌胃;模型组给予等量无菌生理盐水腹腔注射。每组每次取5只小鼠，分别于治疗后24、48、72 h取血标本，观察各组小鼠肠黏膜C反应蛋白（CRP）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）水平变化情况;剖杀，取末端回肠，行苏木精-伊红（HE）染色。

1.4 重症腹腔感染动物模型制备

雄性C57BL/6小鼠于模型制作12 h前禁食，不禁水。模型制备：向腹腔内注入25%灭菌粪便混悬液2 mL/kg，大肠埃希菌液及亲水气单胞菌液各1 mL/kg。

造模成功的评价标准：根据Chiu肠黏膜损伤评分法，小肠黏膜损伤程度为3～4级。光镜下模型组小肠黏膜和黏膜下层间质水肿、血管充血，有中性粒细胞浸润，肠绒毛毛细血管充血，部分区域有黏膜上皮脱落，甚至完全脱失，浆膜层明显炎性渗出。

1.5 CRP、TNF-α、IL-6水平监测

取血标本3 mL，离心获得血清，离心速率3200 r/min，离心时间10 min，离心半径8 cm。采用采用酶联免疫吸附法（贝克曼库尔特AU480）检测小鼠血清CRP、TNF-α、IL-6水平。

1.6 肠黏膜层观察及肠黏膜细胞凋亡检测

收集样本，留取末端回肠（距回盲部约10 cm）长度约5 mm，回肠组织于4%多聚甲醛缓冲液中固定，进行石蜡包埋，常规切片进行HE染色，观察肠道黏膜层情况;另留取部分石蜡切片用于细胞凋亡检测。肠黏膜上皮细胞核染色呈棕褐色的即为阳性细胞，即凋亡细胞。凋亡指数的计算：每张切片随机选取5个不连续的高倍镜视野计数阳性细胞，计数每条小肠绒毛中阳性细胞数和总细胞数，凋亡指数=阳性细胞数/总细胞数，每张切片结果取平均值即为样本的凋亡指数。

1.7 统计学方法

收集整理数据，采用SPSS 23.0进行统计学处理，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验;计数资料以例数或百分比表示，采用χ2检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肠黏膜病理改变

60只小鼠在剖杀处理前均存活。重症腹腔感染24 h后，光镜下模型组小肠黏膜和黏膜下层间质水肿、血管充血，有中性粒细胞浸润，肠绒毛毛细血管充血，部分区域有黏膜上皮脱落，甚至完全脱失，浆膜层明显炎性渗出，腹腔感染24 h后，肠黏膜损伤达高峰（图1）。抗炎组也可见类似表现，但较对照组明显减轻，大片绒毛坏死脱落少见。抗炎+人参组有部分绒毛轻微水肿，顶端上皮受损。

2.2 各组小鼠肠黏膜上皮细胞凋亡指数比较

2.3 各组小鼠肠黏膜CRP、TNF-α、IL-6水平比较

3 讨论

肠屏障包括机械屏障、免疫屏障、生物屏障、化学屏障。机械屏障由上皮层、上皮顶端的紧密连接和黏液层及黏膜血管内皮组成[4]。上皮层是由一层单层柱状上皮细胞紧密排列于肠腔构成，是肠与外界环境之间最主要的组织屏障[5]。上皮顶端之间的紧密连接由多种蛋白质复合物组成，对物质转运起选择作用，可以阻止大分子的进入。黏液层由肠杯状细胞分泌，覆盖上皮表面，可阻止细菌的穿透，稀释、冲刷、黏附有毒物质。正常情况下，肠道正常菌群可抑制其他侵入性微生物的增殖。一旦此平衡紊乱，优势繁殖的细菌便可突破黏膜屏障而移位[6]。

腹腔感染后，肠蠕动功能改变，与肠黏膜屏障损伤有关[7]。本研究显示，重症腹腔感染后，小鼠肠黏膜出现萎缩，肠黏膜上皮细胞凋亡数目明显增多，且肠黏膜萎缩程度越明显，肠黏膜上皮细胞凋亡数目越多。黏膜上皮机械屏障是由上皮细胞刷状缘的严密的脂质双分子层以及细胞侧缘一连串的细胞连接组成的。生理情况下，肠黏膜上皮细胞不断地衰老、死亡和脱落，并不断地由上皮中的未分化细胞增殖补充，这是生理性的更新。当炎症或创伤等原因造成上皮损伤后，上皮细胞具有较强的再生和修复能力，即上皮细胞凋亡和增殖在一定范围内能维持动态平衡，保护机体免受细菌毒素等外界不良因素的侵袭[8-9]。细胞凋亡程序有多个途径，其中包括经内质网途径。内质网是真核细胞中蛋白质合成、折叠与分泌的重要细胞器[10-11]。细胞进化出一套完整的机制来监督和帮助内质网内蛋白质的折叠与修饰。而当错误折叠的蛋白质累积时，细胞通过一系列信号转导途径，对其进行应答，包括增强蛋白质折叠能力、停滞大多数蛋白质的翻译、加速蛋白质的降解等。如果内质网功能紊乱持续，细胞将最终启动Caspase12依赖的细胞凋亡程序[12]。

既往关于重症急性胰腺炎的研究中[13]，从动物模型中采取部分肠黏膜，通过观察，发现重症急性胰腺炎发生时可见肠道黏膜水肿，肠黏膜上皮细胞间紧密连接遭到破坏，肠道上皮细胞凋亡增加，肠微绒毛高度降低，肠道系膜血管收缩，血流量减少，严重者肠黏膜出现溃疡、坏死，肠黏膜出现萎缩，肠黏膜上皮细胞凋亡数目明显增多，同时肠黏膜细胞内分泌功能出现改变。成红刚等[14]也通过对腹腔感染后的大鼠肠黏膜绒毛高度、肠上皮损伤指数和各相应时间点血浆D-乳酸含量进行研究得出：腹腔感染后12 h，大鼠肠绒毛高度明显降低，血浆D-乳酸含量明显升高，肠黏膜损伤评分增加（P < 0.01），且大鼠血浆D-乳酸水平与小肠绒毛高度呈负相关（P < 0.01），与肠黏膜损伤指数呈正相关（P < 0.01）。

人参为五加科人参属植物，主要活性成分为人参皂苷。现代药理研究表明，人参皂苷具有抗肿瘤、抗疲劳、抗衰老、保护心脑血管及神经系统的作用。随着人参药用和保健价值的不断发掘，其有效成分人参皂苷也引起人们越来越多的关注[15-17]。李茜等[18]发表文献指出：人参皂苷Rg1对大鼠肠缺血或再灌注后的肠道有保护作用，该保护作用可能与减少TNF-α、IL-6、MDA含量和提高SOD活性有关。而刘艳艳等[19]通过对小鼠给予人参皂苷灌胃得出：人参皂苷灌胃13 d后，小鼠肠道菌群结构和数量发生明显改变，推测人参皂苷可能以肠道菌群作为发挥生物学作用的靶点，进而起到保护肠黏膜屏障功能的作用。TNF-α具有广泛的生物学效应，可作用于多种细胞，从而激发一系列的炎性反应，导致机体释放大量的IL-6和IL-8等，进一步促进脓毒症的发展[20-21]。IL-6作为一种前炎性细胞因子，与脓毒症的病情呈正相关。CRP是炎性反应的常用检测指标，可反映机体炎性反应水平。本研究中，抗炎组、抗炎+人参组的小鼠肠黏膜CRP、TNF-α、IL-6水平均显著低于模型组（P < 0.05或P < 0.01），且抗炎+人参组的小鼠肠黏膜CRP、TNF-α、IL-6水平较抗炎组更低（P < 0.05），提示人参有助于降低重症腹腔感染后小鼠体内的炎性反应水平。

本研究结果显示人参皂苷可抑制肠黏膜上皮细胞凋亡。既往研究表明，含有人参的中成药，如参附注射液具有抗缺血、缺氧、清除氧自由基、抗脂质过氧化等作用，对多种器官的缺血再灌注损伤等具有保护作用[22]。有研究证实人参对内质网重复蛋白有很好的清除作用[23]。是否因其清除了内质网内异常蛋白，从而减缓了细胞凋亡的启动进程，最终起到保护肠黏膜屏障功能的作用需要进一步研究证实。

本研究通过重症腹腔感染动物模型提示：重症腹腔感染后，肠黏膜萎缩与肠黏膜上皮细胞凋亡增多有关，从而影响肠黏膜细胞内分泌功能，尽早予以中药人参，可以减少因此引起的细胞凋亡，减轻肠黏膜萎缩，从而降低对肠黏膜分泌功能的影响，减改善肠功能紊乱。

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（收稿日期：2018-09-08  本文编辑：张瑜杰）