裸鼠皮下人肝癌种植瘤模型的建立
[摘要] 目的:建立裸鼠皮下人肝癌种植瘤模型。方法:BLBA/c裸鼠颈背部皮下注射人肝癌SMMC-7721细胞悬液5×106个/(0.2 ml·只),观察肿瘤生长情况,10周处死。瘤组织作病理及电镜检查;取种植裸鼠周围血作甲胎蛋白(AFP)的检测,随机抽出10只未行处理的BLBA/c雄性裸鼠作对照;用免疫组化法检测肿瘤微血管密度(MVD),取正常非瘤组织作对照。结果:种植裸鼠周围血甲胎蛋白(AFP) 为(528.35±12.48) ng/ml,对照组为(135.37±9.27) ng/ml,两组比较,有显著性差异(P<0.05);种植裸鼠平均每中倍视野中的微血管数为(32.45±2.38)个。对照组为(9.16±1.21)个,两组比较,有显著性差异(P<0.05)。该模型具有类似人原发性肝癌的形态学特征。结论:成功建立了人肝癌裸鼠皮下种植瘤模型。
[关键词] 肝癌;种植;裸鼠模型
[中图分类号] R735 [文献标识码]A [文章编号]1673-7210(2008)07(c)-027-02
Establishment of the nude mice model transplanted with human liver cancer
YI Shi-jian1, LI Lan-lan1, ZHONG De-wu2, YANG Zhu-lin2, DUAN Lun-xi2
(1.The Fuyong People"s Hospital of Baoan District of Shenzhen City, Shenzhen518103, China;2. Department of Hepatobiliary Surgery, the Second Xiangya Hospital, Central South University, Changsha410011, China)
[Abstract] Objective:To construct nude mice sub-skin model transplanted with human liver cancer.Methods: 5×106/0.2 ml of human liver cancer cell strain SMMC-7721 suspension were injected into sub-skin in the neck of nude mice. The growth of tumor was observed and the mice were executed after 10 weeks.Pathologic examination, detection of AFP in serum by radiation immunization, electronmicroscope observation and detection of MVD by immunohistochemistry were used to observe the growth condition of tumor.Results:The model constructed had the same morphological character compared with the human liver cancer.Conclusion:The nude mice sub-skin model transplanted with human liver cancer is constructed successfully.
[Key words] Human liver cancer; Transplantation; Nude mice model
裸鼠是一种先天性胸腺缺陷的动物。研究表明,人类恶性肿瘤的裸鼠异种种植后,在病理形态、生化代谢、细胞动力学及特殊功能方面与种植前相同,因而是肿瘤实验性研究的较理想模型,已成为在活体状态下研究肿瘤的发生发展、各种生物学特征及筛选抗癌药物必不可少的工具。本文建立了人肝癌裸鼠皮下种植瘤模型,其形态学特征及血清检测等均与人原发性肝癌相似,现报道如下:
1 材料与方法
1.1 材料
细胞株:人原发性肝细胞癌SMMC-77211细胞株[1](购自武汉大学中国典型培养物保藏中心)。主要试剂:1640培养液、小牛血清、0.25%胰蛋白酶。实验动物:BLBA/c雄性裸鼠(购自上海市肿瘤研究所),共30只,5~6周龄,体重(18.1±0.5) g,SPF条件下饲养(中南大学湘雅二医院动物实验室)。电子显微镜:JEM~100cx型电镜(购自日本)。甲胎蛋白放射免疫分析药盒:购自天津九鼎医学生物工程有限公司。放射免疫计数器:GC-1200型(购自中国科技大学科技实业总公司)。免疫组化法试剂:S-P试剂盒(购自武汉博士德生物工程有限公司)。
1.2 方法
1.2.1 癌细胞接种常规培养SMMC-7721细胞,取对数生长期的SMMC-7721肝癌细胞,用0.25%的胰酶消化,PBS洗细胞两次;1 000转/min离心5 min,收集细胞;用0.9%的生理盐水悬浮细胞,定容,细胞以5×106个/(0.2 ml·只)接种于裸鼠颈背部皮下。
1.2.2 裸鼠成瘤情况观察每2~3天用游标卡尺测量肿瘤的长径(a)及短径(b)。取各组长短径平均值,按公式ab2/2,计算肿瘤体积。10周处死裸鼠。
1.2.3 病理及电镜检查剥取肿瘤块,10%福尔马林固定、脱水、透明、浸蜡、包埋,制成5 μm厚切片。苏木素-伊红染色。作常规肿瘤组织病理检查。电镜观察标本处理:瘤组织以3%戊二醛固定1~3 h,缓冲液冲洗后,用1%四氧化锇固定1~2 h,酒精、丙酮梯度脱水和Epon812包埋、醋酸双氧铀与柠檬铅双染色后切片,JEM-100cx型电镜观察。
1.2.4 血清甲胎蛋白(AFP)的检测接种10周后,取裸鼠进行眼静脉丛采血,采用液相平衡竞争放射免疫法(RIA法)检测裸鼠血清中AFP的含量。同时随机抽出10只未行处理的BLBA/c雄性裸鼠(购自上海市肿瘤研究所),5~6周龄,体重(17.9±0.5) g,SPF条件下饲养10周后,取裸鼠进行眼静脉丛采血,采用液相平衡竞争放射免疫法(RIA法)检测裸鼠血清中AFP的含量,与研究组对照。
1.2.5 肿瘤血管密度(MVD)的检测肿瘤组织常规切片后,根据试剂盒说明书操作制片。先在低倍镜下寻找高血管密度区,即“热点”,再用中倍镜在热点中计数被抗CD34抗体染成棕黄色的血管数目。取3个热点的平均血管数(直径﹥8个红细胞直径的血管不算在内)。取正常非瘤组织作为对照。
1.3 统计学处理
计量资料以(x±s)表示,组间均数比较采用t检验或Fisher精确概率计算,P<0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1裸鼠成瘤情况观察
平均15 d,裸鼠颈背部皮下出现种植瘤,直径为0.4~0.5 cm,成瘤率为100% (30/30)。而且随着时间的增加而增大,无自发消退现象。
2.2 病理及电镜检查结果
苏木素-伊红染色肿瘤细胞与人肝癌相似,生长良好,细胞呈多角形,核大深染,核分裂像多见(图1)。电镜观察:肝癌细胞分化较好,细胞核异染色质丰富,胞质中线粒体、内质网丰富,部分内质网扩张,可见脂滴和毛细血管、胆色素小体等类似人肝癌细胞的特征,见图2。
2.3血清甲胎蛋白(AFP)的检测结果
血清甲胎蛋白的分泌量为(528.35±12.48) ng/ml,对照组为(135.37±9.27) ng/ml,两组比较,有显著性差异(P<0.05)。
2.4肿瘤血管密度(MVD)的检测结果
肿瘤微血管内皮细胞染成黄棕色,血管较多,分布于视野中。平均每中倍视野中的微血管数为(32.45±2.38)个,见图3。对照组平均每中倍视野中的微血管数为(9.16±1.21)个。两组比较,有显著性差异(P<0.05)。
3 讨论
自1969年学者首次将人结肠癌成功地在裸鼠体内传代种植开始[2],裸鼠便广泛地用于人类肿瘤的基础理论和临床治疗的实验性研究。迄今几乎所有的人恶性肿瘤均能在裸鼠上种植。种植物一般分为三种:①人类肿瘤外科标本直接种植。②已在其他宿主系统建立的人类肿瘤可种植株。③体外培养人类肿瘤细胞系的种植。裸鼠用作肿瘤种植实验,方法简单,无需对动物作特殊前处理,而且异种肿瘤种植成功率相当高。种植传代后的肿瘤组织仍保留其原有的生物学特性,种植瘤可以一直在裸鼠体内或体表生长。其所产生的瘤体生长类型基本相同,而且皮下种植瘤体不与皮肤及皮下组织粘连,极易分离便于观察、测量和活体检查。种植瘤原有的形态与生物学特性基本保持不变;肿瘤细胞染色体核型分析表明,传代肿瘤仍保留原肿瘤的核型;用其他同工酶及免疫方法分析,发现人类恶性肿瘤种植传代后的瘤体仍保持人类恶性肿瘤的特点。
影响种植成功的因素包括:种植部位及接种途径、接种物的含菌量、接种物的浓度、肿瘤类型、动物的营养状况等。对于本模型来说,应考虑以下影响因素:①性别。如肝癌、前列腺癌易种植于雄性裸鼠,乳腺癌则在雌性裸鼠体内生长得更好[3]。②鼠龄。裸鼠的鼠龄也是一个重要的因素,一般宜选择4~6周龄的裸鼠进行实验。因为鼠龄过大,裸鼠体内产生较多的NK细胞,影响肿瘤的种植成功率。③接种瘤细胞量。接种量过少,种植瘤不易成活;接种量过大,则会引起肿瘤的失控生长,对将来的实验干预带来负面影响。一般认为以5×106个/(0.2 ml·只)为较适宜的接种量[4]。④裸鼠的营养状况。在本实验开始时,我们未注意这点,仅用高压灭菌饲料喂养,裸鼠体重轻,营养状态不佳,且肿瘤生长慢;加喂灭菌葵花子和熟鸡蛋后,情况明显改观。本研究用4~6周龄雄性裸鼠进行实验,人肝癌细胞株SMMC-7721以5×106个/(0.2 ml·只)接种于裸鼠颈背部皮下,成功建立人原发性肝癌裸鼠种植瘤模型。该模型种植成功率高,成瘤率达100% (30/30),肿瘤生长稳定。但该模型的不足之处在于不能模拟人原发性肝癌临床实践中常见的复发转移等生物学特性。在实验全过程中,全部裸鼠,均未发现体表淋巴结及腹腔淋巴结转移;对荷瘤裸鼠的肝、肺随机取材,进行病理检查,亦未发现转移灶存在。这与癌细胞及种植环境有很大关系[5]。其原因可能为SMMC-7721肝癌细胞株的长期传代,而导致侵袭性生长及高复发、高转移等生物学特性丧失。因此,该模型不适用于人原发性肝癌复发转移的研究。
[参考文献]
[1]汤钊猷.裸鼠人体肝癌种植模型的研究:模型的建立及血清学与形态学特征[J].上海第一医学院学报, 1982, (1):21-25.
[2]Sun F, Tang Z, Lui K, et al.Establishment of a metastatic model of human hepatocellular carcinoma in nude mice via orthotopic implantation of histologically intact tissues[J].Int J Cancer, 1996, 66(2):239-243.
[3]陈陵际.运用人癌裸小鼠种植瘤模型进行抗癌新药评价[J].上海实验动物科学, 2001, 21 (4):247-250.
[4]Yamamoto C, Takemoto H, Kuno K, et al. Cycloprodigiosin hydrochloride, a new H (+) /CI (-) symporter, induces apoptosis in human and rat hepatocellular cancer cell lines in vitro and inhibits the growth of hepatocellular carcinoma xenografts in nude mice[J].Hepatology, 1999,30 (4):894-902.
[5]Fujihara T, Sawada T, Hirakawa K, et al. Establishment of lymph node metastatic model for human gastric cancer in nude mice and analysis of factors associated with metastasis [J].Clin Exp Metastasis, 1998,16 (4):389-398.
(收稿日期:2008-06-20)
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