TGF—β1抑制剂Decorin对子宫内膜癌细胞HBC—1B迁移、侵袭转移能力的影响

材料与方法

1.1 材料

人子宫内膜癌细胞株HEC-1B购自中科院上海细胞库。TGF-β1购自PeproTech公司，重组人核心蛋白聚糖Decorin购自R&D公司，胰蛋白酶购自Gibco公司，DMEM/F12培养基、胎牛血清（FBS）购自美国Hyclone公司。Transwell小室购自Corning公司，人工基底膜基质凝胶（Matrigel）购自BD公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 HEC-1B细胞培养于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 U/ml链霉素的DMEM/F12培养液中，于37℃、5%CO2培养箱中培养，每48小时换液1次，0.25%胰蛋白酶消化传代。倒置显微镜下观察细胞的生长及形态的变化。细胞呈单层贴壁生长，选用对数生长期细胞进行实验。

1.2.2 实验分组 取对数生长期HEC-1B细胞，每种细胞均设4组：阴性对照组（未经TGF-β1及Decorin处理）、TGF-β1组（TGF-β1的终处理浓度为10 ng/ml）、Decorin组（Decorin的终处理浓度为100 ng/ml）、TGF-β1和Decorin组（终处理浓度分别为10、100 ng/ml），置37℃、5%CO2培养箱内继续培养，24 h后换液，48 h后终止培养，收集细胞。

1.2.3 MTT法检测细胞增殖抑制能力 取5×104/ml的HEC-1B细胞接种于96孔培养板，每孔100 μl，每孔细胞数约为5×103个，置37℃、5%CO2培养箱中培养24 h，后分为4组，分别加入TGF-β1及 Decorin，继续培养48 h。终止培养前加MTT（5 g/L），每孔20 μl，37℃再培养4 h，吸出上清液，加DMSO 150 μl/孔，低速振荡至紫色结晶完全消失，然后在酶标仪上490 nm处测定吸光度值。按下列公式计算细胞增殖抑制率：细胞增殖抑制率（%）=[1-（实验组A值-空白对照孔A值）/（阴性对照组A值-空白对照孔A值）]×100%。实验重复3次。未接种细胞，只含5%胎牛血清的DMEM/F12培养基、MTT和DMSO的溶剂对照组为空白对照孔。

1.2.4 细胞迁移实验和侵袭实验 取阴性对照组、TGF-β1组，TGF-β1和Decorin组作用24 h后细胞，PBS洗涤细胞，加入0.25%胰酶消化细胞，予含0.1%胎牛血清的培养基重悬细胞，制备单细胞悬液。

1.2.4.1 细胞迁移实验 Transwell上室加入上述各组100 μl细胞悬液，细胞密度为1×105/ml，下室加入600 μl含10%胎牛血清的完全培养基。于37℃、5%CO2培养箱中继续培养24 h后，取出小室，擦去上室内侧面未迁移细胞，用甲醇固定20 min，室溫下0.1%结晶紫染色25 min，于显微镜下每个小室随意选取5个视野进行细胞计数，求平均值。每组实验重复3次。

1.2.4.2 细胞侵袭实验 将无血清培养基和Matrigel按照8∶1稀释，取50 μl稀释的Matrigel铺在Transwell小室的上室内，涂匀，放入37℃、5%CO2培养箱中2 h，吸净未干的Matrigel。之后的步骤同细胞迁移实验。在显微镜下取5个视野进行细胞计数后取平均值，得出每个视野的侵袭细胞数。每组实验重复3次。

1.3 统计学处理

采用统计学软件SPSS 16.0分析数据，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 各组子宫内膜癌细胞HEC-1B的增殖能力的比较

以终浓度分别为0、10 ng/ml TGF-β1，100 ng/ml Decorin、10 ng/ml TGF-β1+100 ng/ml Decorin分别作用于HEC-1B细胞48 h，MTT检测细胞增殖/活力。结果显示，100 ng/ml Decorin作用后细胞活力/活细胞数有所下降，与阴性对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）（表1），提示Decorin能明显抑制HEC-1B细胞增殖。

2.2 各组子宫内膜癌细胞HEC-1B迁移、侵袭能力的比较

与阴性对照组的HEC-1B细胞迁移数[（84.4±3.48）/HP]比较，TGF-β1组的HEC-1B细胞迁移数[（109±7.54）/HP]明显更高，差异有统计学意义（P<0.05），TGF-β1+Decorin组[（91.4±8.21）/HP]略高（P>0.05），而TGF-β1+Decorin组的细胞迁移数明显低于TGF-β1组，差异有统计学意义（P<0.05）。

与阴性对照组的HEC-1B细胞侵袭数[（29.8±6.89）/HP]比较，TGF-β1组的HEC-1B细胞侵袭数[（65.2±5.23）/HP]明显升高，差异有统计学意义（P<0.01）， TGF-β1+Decorin组[（38.6±9.31）/HP]略高（P>0.05），而TGF-β1+Decorin组的细胞侵袭数明显低于TGF-β1组，差异有统计学意义（P<0.05）。

3讨论

在肿瘤的复发及转移过程中，多种细胞因子参与并起重要作用。近年来越来越多的研究表明，EMT使肿瘤细胞间黏附性减弱，运动能力增强，在一系列信号分子的调控下，帮助细胞向周围组织渗入或向远处转移。EMT指具有极性及紧密黏附力的上皮细胞转化为无极性、流动性强的间质细胞的病理生理过程，主要表现为上皮细胞的极性丧失及间质细胞迁移能力获得，是肿瘤细胞远处转移的关键环节[11]。TGF-β信号通路、Wnt信号通路、Hh途径、Notch信号途径、核因子（NF）-κB等途径参与EMT的调控[12-13]。TGF-β是一种多功能的细胞因子，与恶性肿瘤细胞的侵袭、转移关系密切，参与多种恶性肿瘤转移过程[14-16]。Miettinen等最早发现，TGF-β能诱导正常的乳腺上皮细胞发生EMT，获得类似成纤维细胞的形态。张琳等[7]的研究发现在乳腺癌中，5 μg/L TGF-β1作用乳腺癌细胞72 h后，可诱导EMT。李鹏等[8]的研究发现，用10 ng/ml TGF-β处理Ishikawa和HEC-1A细胞48 h后，采用蛋白印迹法检测EMT相关标志蛋白E-cad、N-cad、Vim蛋白的表达，结果发现，两种细胞中上皮生物标志物钙粘蛋白（E-cad）表达水平均下降，间质生物标志物神经钙粘蛋白（N-cad）、波形蛋白（Vim）表达水平均升高，提示在ER阳性的Ishikawa细胞和ER阴性的HEC-1A细胞中，TGF-β均能诱发EMT。解刚强等[9]采用外源性人重组TGF-β1及其受体拮抗剂LY2109761作用于人胃癌細胞株SGC7901，显示TGF-β1可诱导胃癌细胞发生EMT，增强其侵袭能力，这种作用可被其受体拮抗剂LY2109761所抑制。本研究采用10 ng/ml TGF-β1作用于HEC-1B细胞24 h，Transwell实验显示，TGF-β1组穿膜细胞数较对照组明显增多（P<0.05），提示TGF-β1可明显增强HEC-1B细胞的迁移侵袭能力，与上述研究结果一致。

Decorin是一种广泛分布于人体组织中的小分子蛋白多糖，是细胞外基质的重要组成部分。目前研究发现DCN 基因是一种抑癌基因，具有抑制实体肿瘤生长或转移的能力[10，17]。其抗肿瘤机制尚未明确，研究显示Decorin是具有TGF-β活性的天然负反馈调节因子，Decorin可通过抑制TGF-β细胞通路作用，并诱导肿瘤细胞自噬，进而抑制神经胶质瘤细胞U87MG的侵袭及转移[18]，亦可通过稳定和提高E-cad蛋白的表达水平抑制结肠癌的生长和转移[19]。Goldoni等[20]发现，Decorin 可有效抑制乳腺癌细胞在原发灶的生长和远处转移，提出Decorin 可作为乳腺癌靶向治疗的候选药物之一。Decorin能否阻断TGF-β诱导子宫内膜癌的EMT，目前尚无研究。本研究用100 ng/ml Decorin作用于人子宫内膜腺癌HEC-1B 细胞系，观察其对细胞增殖及侵袭力的影响。本实验MTT结果提示，该浓度Decorin作用HEC-1B细胞48 h后，抑制率为11.1%。本文进一步研究显示，分别用Decorin和TGF-β1作用于HEC-1B细胞24 h后，TGF-β1组穿膜细胞数较对照组明显增多（P<0.05），Decorin和TGF-β1联合用药组穿膜细胞数较对照组比较差异无统计学意义（P>0.05），Decorin和TGF-β1联合用药组与TGF-β1组比较穿膜细胞数明显较少，两组差异有统计学意义。上述数据表明，应用TGF-β1抑制剂Decorin后，HEC-1B细胞的细胞增殖率、迁移数及侵袭数均明显下降，提示Decorin通过对TGF-β1的拮抗作用，降低了TGF-β1增强的侵袭能力，抑制了HEC-1B细胞的生长、迁移和侵袭。

本实验证实Decorin能抑制人子宫内膜癌细胞的增殖，并可降低子宫内膜癌细胞的侵袭转移能力。Decorin具体以何种机制抑制肿瘤细胞增殖及转移，将是下一步的研究方向。

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（收稿日期：2017-08-09 本文编辑：许俊琴）