对CRISPR—Cas系统的简单介绍

材料实验室认为在应用Cas9系统时Cas9蛋白和sgRNA2个组分切割DNA的效率要高于Cas9蛋白、pre-crRNA和tracrRNA 3个组分的切割效率。

到目前为止，已经基本明确了CRISPR/Cas系统的作用过程，分为3个阶段：获得CRISPR的间隔区（即由于噬菌体或质粒的入侵导致一小段DNA序列整合到宿主基因组的CRISPR位点的5’端2个重复序列之间形成的基因序列）；CRIPSR基因座的表达（包括转录和转录后的成熟加工，最后生成crRNA）；CRISPR/Cas系统活性的发挥或者是对外源遗传物质的干扰。一旦发生同种质粒或噬菌体入侵，CRISPR的repeats序列截取和保留的入侵的spacers DNA片段转录形成crRNA。由上文可知，tracrRNA、crRNA以及Cas9蛋白构成复合体，能够识别紧随protospacer序列后的PAM序列，Cas蛋白会对与crRNA互补的入侵的双链DNA进行切割，从而使细菌具有对抗同类噬菌体再次入侵的能力。

Cas9蛋白是由细菌DNA编码的，要想让其在哺乳动物细胞核内高效表达，就需要将真核细胞的核定位信号加到Cas9蛋白的C端或N端。关于该问题到目前为止有几种不同的观点：有学者认为要使Cas9蛋白高效转运必须在蛋白两端都加NLS才可以；还有学者认为只需在蛋白C端加上核定位信号，CRSIPR/Cas9系统就能在真核细胞中高效地发挥功能；但Shen的研究结果认为只有在N端添加核定位信号并且在核定位信号与Cas9蛋白间加上32个氨基酸残基的接头才能使蛋白发挥其作用。这可能是由于Cas9蛋白折叠后形成的空间结构影响了NLS的功能，加入一定距离的氨基酸后可以在某种程度上减轻或消除这种影响。分析目前已经发表的论文，提高核转运最有效的方法似乎是把核定位信号加在Cas9蛋白的C端[4]。

3 CRISRP/Cas系统的应用及前景

虽然目前对CRISPR/Cas系统的了解还不够深入，但其强大的实用价值已经被应用在工业和学术领域。工业上较为成功的是利用该系统构建出具有噬菌体抗性的菌株以提高奶制品发酵的产量。也能把它的这种特性用于菌株分类，以及防止某些特殊质粒的扩散，防止基因污染，以保存菌株。

CRISPR/Cas系统不仅可以用来进行基因敲除，还可以敲入基因。可以在CRISPR/Cas系统切割目的基因的同时，通过同源重组修复断点的原理引入特定突变或者插入目的基因片段。该技术已经成功应用于细菌、斑马鱼、果蝇、线虫、酵母、小鼠、人类细胞以及水稻等[5]。

CRISPR/Cas系统除了可以在分子水平研究基因功能，还可以用在细胞水平建立疾病模型，治疗遗传疾病以及进行细胞替代治疗[6]。HIV-1病毒有时能以休眠状态存在于人类宿主细胞中，如果将LTR-targeting CRISPR/Cas9复合物导入HIV病毒或者已经诱导的T细胞中，可以使HIV失去致病性。更重要的是，该复合物甚至能够剪切己经插入宿主染色体上的病毒基因[7]。

CRISPR/Cas系统作为一种新型的基因组定点修饰技术，它的出现大大推动了对基因功能的研究。但作为一种新兴的技术，它的基础理论研究还远远不够，很多分子机制尚不明确，技术也不够成熟。尽管现在还存在诸如如何将构建的系统成功导入人体内、脱靶现象以及切割特异性略低于TALEN等问题，但是相信在不久的将来一定可以找出解决的方案。总之，CRISPR-Cas系统研究时间虽短，但发展迅猛，以后 一定会有更广泛的应用。

参考文献

[1] Kim YG，Cha J，Chandrasegaran S[J]. Hybrid restriction enzymes：zinc finger fusions to Fok I cleavage domain[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 1996， 93（3）： 1156-1160.

[2] Breakthrough of the year[J].The runners-up.Science， 2012338（6114）：1525-1532.

[3] Mussolino C， Cathomen T. RNA guides genome engineering[J]. Nat Biotechnol，2013，31（3）：208-209.

[4] 方锐，等.CRISPR/Cas9介导的基因组定点编辑技术[J].生物化学与生物物理进展，2013，40（8）：691-702.

[5] 李君，等.CRISPR/Cas系统：RNA靶向的基因组定向编辑新技术[J].遗传，2013，35（11）：1265-1273.

[6] 倪培凌，等.DNA剪刀——TALEN和CRISPR/Cas[J].中国细胞生物学学报，2014，36（1）：5-11.

[7] 王梦瑶，等.基于CRISPR-Cas系统的基因组定点修饰新技术[J].中国生物化学与分子生物学报，2014，5，30（5）：426一433.

作者简介：张瑞（1992-），女，河北省邢台人，河北农业大学生命科学学院生物技术专业本科生。