酶解辅助提取桑黄粗多糖的工艺优化

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1.1   材料与试剂

（1）桑黄子实体。采自长白山国家自然保护区，经鉴定后粉碎过筛备用;木瓜蛋白酶（60×104 U/g），南宁庞博生物工程有限公司提供;其他试剂均为化学纯或分析纯。

（2）6%苯酚溶液。精确称取6 g重蒸苯酚，置于100 mL量瓶中，用蒸馏水定容至刻度。

（3）木瓜蛋白酶。精确称取0.2 g的木瓜蛋白酶粉末，溶解，置于100 mL量瓶中，用蒸馏水定容至刻度。

（4）DNS试剂。酒石酸钾钠182 g，溶于500 mL蒸馏水中，加热（不超过50 ℃），于热溶液中依次加入3，5 -二硝基水杨酸6.3 g，NaOH2 1 g，苯酚5 g，无水亚硫酸钠5 g，搅拌均匀，冷却后用蒸馏水定容至1 000 mL，贮于棕色瓶中，室温下放置7 d后使用。

1.2   仪器与设备

BS110S型精密电子天平，北京赛多利斯天平有限公司产品;HH-4型数显恒温水浴锅，金坛市富华仪器有限公司产品;SHZ- D（Ⅲ）型循环水式真空抽滤机，巩义市英峪予华仪器厂产品;752N型紫外线可见光光度计，上海精密科学仪器有限公司产品。

1.3   试验方法

1.3.1   还原糖的测定——DNS法

精确称取105 ℃干燥恒质量的标准葡萄糖50 mg，定容于100 mL容量瓶，配制成质量浓度为0.5 mg/mL的标准葡萄糖标准溶液。按表1添加试剂于10 mL具塞试管，沸水浴5 min，然后迅速流水冷却，定容至10 mL，于波长540 nm处测定吸光度。以葡萄糖质量浓度为纵坐标，以吸光度为横坐标，绘制还原糖标准曲线，还原糖标准曲线的回归方程为：Y=   0.354 9X+0.015 6，R2=0.999 3，其中Y为葡萄糖质量浓度，X为吸光度。

还原糖标准曲线的试剂用量见表1。

1.3.2   总糖含量的测定——硫酸—苯酚法

精确称取105 ℃干燥恒质量的标准葡萄糖100 mg，定容于100 mL容量瓶，配置成质量浓度为1 mg/mL的标准葡萄糖母液，取上述母液10 mL于100 mL容量瓶中，配置成质量浓度为0.1 mg/mL的葡萄糖标准溶液。

按表2添加试剂后，振荡混匀，于室温下放置30 min，于波长490 nm处测定OD值，做3个平行，求平均值。以葡萄糖质量浓度为纵坐标，以吸光度为横坐标，绘制标准曲线，多糖标准曲线的回归方程为：Y=0.163 7X-0.003 8，R2=0.999 1，其中Y为葡萄糖质量浓度，X为吸光度。

总糖标准曲线的试剂用量见表2。

1.3.3   多糖含量的测定

多糖含量=总糖含量-还原糖含量.

吸取样品液1.0 mL，按上述步骤操作，测光密度，按回归方程求出样品溶液中总糖含量。

吸取样品液2.0 mL，按上述步骤操作，测光密度，按回归方程求出样品溶液中还原糖含量。

1.3.4   工艺流程

桑黄子实体干燥粉碎→过目（60目）→酶解→灭酶→→抽滤→上清液→测定多糖含量。

1.3.5   桑黄多糖单因素提取条件研究

（1）酶添加量的选择。称取5份桑黄样品各1 g，在确定的料液比、提取时间和提取温度的条件下，分别于按照0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.5%添加木瓜蛋白酶进行提取，测定提取液中粗多糖的质量浓度，比较酶添加量对多糖提取率的影响。试验重复3次。

（2）提取温度的选择。称取5份桑黄样品各     1 g，在确定的料液比、提取时间和酶添加量的条件下，分别于不同温度如30，40，50，60，70 ℃下提取，测定提取液中粗多糖的质量浓度，比较提取温度对多糖提取率的影响。试验重复3次。

（3）料液比的选择。称取5份桑黄样品各1 g，在确定的提取时间、提取温度和酶添加量的条件下，分别按照不同料液比1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50进行提取，测定提取液中粗多糖的质量浓度。比较料液比对多糖提取率的影响。试验重复3次。

（4）提取时间的选择。称取5份桑黄样品各     1 g，在确定的料液比、提取温度和酶添加量的条件下，分别选用不同的提取时间20，40，60，80，100 min，测定提取液中粗多糖的质量浓度，比较提取时间对多糖提取率的影响。试验重复3次。

1.3.6   正交试验

根据单因素的试验结果，确定木瓜蛋白酶的添加量为0.3%，用正交试验对酶解时间、酶解温度和料液比进行三因素三水平的正交试验，每组条件下取桑黄样品1 g，分别用酶解提取3次，确定粗多糖的质量浓度。

正交试验因素与水平设计见表3。

2   結果与分析

2.1   单因素试验

2.1.1   木瓜蛋白酶添加量对多糖提取率的影响

木瓜蛋白酶添加量对多糖提取率的影响见图1。

由图1可知，在木瓜蛋白酶添加量小于0.3%时，提取率随添加量的增加而迅速提高，在大于0.3%时，提取率变化不明显，趋于平稳。说明在木瓜蛋白酶的添加量达到0.3%时，酶对反应物的催化作用逐渐达到饱和，再增加酶的添加量，也是增加酶的消耗量，而对反应没有太大影响。所以选择木瓜蛋白酶的最佳添加量为0.3%。

2.1.2   提取温度对多糖提取率的影响

提取温度对多糖提取率的影响见图2。

由图2可知，提取率先随着温度的提高不断提高，提取温度为50 ℃时提取率达到最大，说明在较低温度时，木瓜蛋白酶的活性随着温度的升高而增大。高于50 ℃后，总体提取率降低，且呈现不规律的波动现象，但差异不显著。这可能可能由于温度超出了木瓜蛋白酶的活性范围，酶发生变性或者活力下降，从而使酶催化反应不能正常进行。所以在其他条件一定时，选择50 ℃为最佳提取温度。

2.1.3   料液比对多糖提取率的影响

料液比对提取率有显著的影响，选择的比例过大，会减少了酶与底物作用的几率，比例过小，有关溶剂的用量和能耗都会大量增加。

料液比对多糖提取率的影响见图3。

由图3可知，随着物料浓度的减小，多糖提取率先上升后下降，提取率在料液比为1∶30时最大。因此，选择最佳料液比为1∶30。

2.1.4   提取时间对多糖提取率的影响

提取时间对多糖提取率的影响见图4。

由图4可知，提取时间对多糖提取率有明显的影响，随着提取时间延长多糖提取率先升高后降低，在提取时间为60 min时提取率达到最大。说明在提取时间小于60 min时，随反应的进行提取出的多糖增多。而在提取时间大于60 min时，在提取完全后，随着加热的继续进行，使反应产物多糖发生降解，从而使反应产生的产物变少。因此，选择最佳提取时间为60 min。

2.2   正交试验优化

正交试验结果见表4。

通过正交试验结果直观分析，由R值可知，所选因素对桑黄多糖提取率的影响由大到小依次为提取时间> 提取温度> 料液比。最优工艺为A1B2C3，即提取时间40 min，提取温度50 ℃，料液比1∶40。采用优化工艺参数条件进行验证试验，经过3次重复试验，平均提取率达到1.52%，且表明该工艺较稳定。

3   结论

桑黄子实体中粗蛋白含量达到5.48%，是多糖含量的2倍多，菌丝体中粗蛋白更是达到36.46%[31]。脱除蛋白的桑黄多糖才能更好地进行相关研究，有利于桑黄多糖的纯化工艺和结构分析。目前已有很多研究通过各种方法（Sevag法、三氯醋酸法和三氯醋酸与酶结合法）除去桑黄粗多糖提取液的蛋白，以进行下一步的纯化分析。但是这些方法各有优缺点，如在酸性条件脱除蛋白可能会影响桑黄多糖的活性[31-33]。因此，如果在桑黄多糖提取的过程中通过酶解的方法除去粗蛋白或与多糖结合的蛋白，可为后续工作提供便利，节约能源。试验在对比了多种蛋白酶的酶解效果基础上，选取了木瓜蛋白酶进行酶解辅助提取工艺优化。在单因素试验的基础上，经正交试验优化分析，确定了酶解辅助提取桑黄多糖的工艺参数为木瓜蛋白酶添加量0.3%，提取时间40 min，提取温度50 ℃，料液比1∶40（g∶mL）。以期为桑黄多糖的提取、纯化、结构测定及药理活性的研究奠定一定的技术基础。

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