现代仪器分析在酶学性质研究中的应用

摘 要：本文综述了光谱法、电位分析法、高效液相色谱法、毛细管电泳法、电喷雾质谱法、X射线晶体衍射法、核磁共振法和冷冻电子显微镜技术等现代仪器分析在酶学性质研究中的应用。

关键词：现代仪器分析；酶学性质；应用

酶是指具有生物催化功能的高分子物质，在食品、健康、医药、工业、畜牧业等方面起重要作用。一直以来，酶学性质吸引着国内外众多学者的关注。酶学性质的研究主要包括最适温度、最适pH、温度稳定性、pH稳定性、底物谱、反应机制及动力学等。目前，仪器分析技术的创新推动了酶学性质研究的迅速发展。本文主要介绍了现代仪器分析在酶活及酶结构测定中的应用。

一、酶活测定

（1）光谱法。紫外可见吸收光谱法是研究在200～800nm波长光区内分子吸收光谱的一种方法。其测定酶活的原理是，在一定的波长下，随着产物浓度的增加，吸光值增大，依据吸光值随时间变化的关系计算出酶活。该分析法具有操作简单、快速、价格便宜等特点。荧光光谱分析法是指利用某些物质可以产生荧光的特性及其强度进行物质的定性和定量的分析方法。李秀芬等人在测定蛋白酶的活力时，将蛋白酶与底物反应一定时间后，用F-2700荧光分光光度计定量，由此测出酶活力。红外光谱法是对各种吸收红外光的化合物的定量和定性分析的一种方法。其酶活检测的原理是，用单位时间内，反应物或者产物在IR光谱中特征吸收峰的峰位或强度的变化量来反映酶活。该方法能连续地监测酶促反应的进程，还可排除内源性因素的干扰，克服由孵育操作带来的信息遗失，开展胞内酶活力的原位测定。

（2）电位滴定法。电位滴定法是在滴定过程中通过测量电位变化以确定滴定终点的方法。其酶活测定的原理为，酶反应使溶液的pH发生改变，加人标准碱（或酸）溶液后使溶液的pH恢复到原值，在一定时间内根据样品所消耗的碱（或酸）溶液体积，即可推算出酶活力。崔春等通过确定一些参数对铵离子选择性电极响应值的影响，建立了一种谷氨酰胺酶活力的测定方法。

（3）高效液相色谱法。高效液相色谱法测定酶活的原理是，通过测定反应前后底物（或产物）含量的变化，计算出酶活。根据分离机制的不同，可分为下述几种类型：液—液分配色谱法、液—固色谱法、化学键合相色谱法、离子交换色谱法和凝胶色谱法。常用的检测器有紫外检测器、示差折光检测器和荧光检测器。紫外检测器适用于对紫外光（或可见光）有吸收性能样品的检测。示差折光检测器适用于与流动相折光率不同的样品组分检测，但不适用于痕量分析和梯度洗脱样品的检测。荧光检测器只适用于具有荧光的有机化合物的测定。其灵敏度很高，痕量分析和梯度洗脱样品的检测均可采用。高效液相色谱法稳定、可靠、精密度高、重复性好，被广泛使用。

（4）毛细管电泳法。毛细管电泳法是指以毛细管为通道，以高压直流电场为驱动力，依据各组分的淌度和分配行为的差异而实现分离的一种分析方法。Masatake Sano2004年提出了激光诱发荧光的毛细管凝胶电泳法来测定胶原蛋白酶的酶活力。

（5）极谱法。极谱法（polarography）是通过测定电解过程中所得到的极化电极的电流-电位曲线来确定被测物质浓度分析方法。极谱法可以测定反应前后底物（或产物）含量的变化，计算出酶活。已有报道运用极谱法测定SOD酶活。

二、酶的结构分析

（1）光谱法。红外光谱是研究表征分子结构的一种有效手段。许多有机官能团在红外光谱中都有特征吸收，通过测定，人们可以判定样品中存在哪些官能团，进而确定未知物的化學结构。该方法是常见的鉴定蛋白质二级结构的方法。蛋白质的二级结构有α-螺旋、β-折叠、β-转角等。这些结构都有特定的氢键结构，而氢键结构的差异可通过红外光谱得到反映。其测定过程使用样品量少，不受光散射和荧光的影响，能够实现动力学研究，具有操作简便、分辨率好、灵敏度高等优点。荧光光谱法即根据荧光分光光度计分析分子结构的方法。其具灵敏度高、选择性好、分析试样量等优点。但分析过程及要求相对复杂，且由于对环境因素较敏感，干扰因素较多，该方法的应用受到一些限制。

（2）电喷雾质谱法。典型的电喷雾质谱源是一个金属或玻璃的毛细管。在毛细管的出口处与反电极之间施加一高电压，分析物以单电荷或多电荷离子的形式进入气相。多电荷离子的产生扩展了普通质谱仪分析的质量范围，使质谱仪可以分析分子量为几十万质量单位的蛋白质分子。黄志坚等提到用电喷雾质谱法可以得到蛋白酶的整体三级结构。

（3）X射线晶体衍射法。X射线晶体衍射法是测定生物大分子结构的一个重要手段。它可用于测定分子量高达106kDa的生物大分子结构。其原理是：在物质的微观结构中，原子和分子的距离在X射线的波长范围内，晶体对X射线的散射和衍射传递着丰富的结构信息。这种方法的缺点是，测定步骤复杂，且无法用来解析难以获得高质量晶体或难以结晶的蛋白结构。

（4）核磁共振法。核磁共振是原子核在外磁场作用下自旋，能级发生蔡曼分裂，共振吸收某一定频率的射频辐射的物理过程。记录这种波谱可对有机化合物进行结构分析。该方法的优势是得到蛋白更加近似于生理环境中的结构，但仅限于测定分子量小于30kDa的生物大分子。

（5）冷冻电子显微镜技术。冷冻电镜是用于扫描电镜的超低温冷冻制样及传输技术，可实现直接观察液体、半液体及对电子束敏感的样品。快速冷冻技术可使水在低温状态下呈玻璃态，从而不影响样品本身结构。冷冻电子显微镜技术还突破了X-射线晶体学只能研究三维晶体样品和核磁共振波谱学只能研究小分子量样品的限制，适合测定分子量特别大的生物大分子结构，但目前最高的分辨率只有3.5A左右，无法提供更多的细节信息。

（6）高效液相色谱法。高效液相色谱法可对蛋白质一级结构进行分析。蛋白质序列分析是在Edman降解的基础上，结合RP-HPLC进行测定的。但是，用RP一HPLC分析蛋白质时，常遇到检测结果的相关性较差的问题。

三、结语

综上所述，应用于酶学性质研究的现代仪器分析方法有很多。它们各有优点和局限性。研究人员可根据自己样品的特性和研究目的来选择合适的分析方法。另外，随着技术的进步，人们对分析仪器的需求也在不断更新，分析仪器面临着提高灵敏度、准确性和稳定性，提供更多信息等挑战。

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