苯甲基磺酰氟在低温保存人类精子中的应用

【摘要】目的：探讨苯甲基磺酰氟（Phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）对低温保存的人类精子存活率及DNA双链不完整性的影响。方法：将新采集的80份人类精液分成两等份，其中一份加入PMSF冷冻保护剂，另一份不加入PMSF冷冻保护剂，将两份标本保存在4℃冰箱中，通过实验比较精子在两种状态下30min～120h内精子活率及DNA双链不完整率差异。结果：低温保存30min～120h，不加入冷冻保护剂组精子平均活率及DNA双链不完整率分别为：（73.2±2.74）%、（67.3±2.56）%、（56.5±2.42）%、（47.4±2.18）%、（41±2.58）%、（30.8±2.64）%；（7.3±1.35）%、（13.8±1.26）%、（16.3±1.56）%、（25±1.36）%、（34.2±1.34）%、（39.2±1.52）%；低温保存30min～120h，加入冷冻保护剂组精子平均活率及DNA双链不完整率分别为：（73.2±2.36）%、（70.2±2.68）%、（59.8±2.46）%、（51.2±2.68）%、（44.5±2.95）%、（33±2.89）%；（7.3±1.45）%、（11.5±1.64）%、（14.3±1.68）%、（22±1.58）%、（30.8±1.65）%、（35.7±1.87）%。结论：低温保存30min～120h之内，精子活率及DNA双链不完整率的差异有统计学意义，在同样的条件下加入PMSF冷冻保护剂同不加入PMSF冷冻保护剂进行低温保存相比，精子的平均活率和DNA双链不完整率的差异无统计学意义。使用与不使用PMSF冷冻保护剂对人类精子进行低温保存都是可行的，如使用PMSF，最佳保护效果只维持在48h之内，之后随时间延长，精子活率降低，DNA双链不完整率升高，120h之后精子几乎没有活率。

【关键词】低温保存法；精子；冷冻保护液；PMSF

Analysis of the influence of PMSF on human sperm in low temperature preservationLI Aohang. Clinical Laboratory Center， Beijing Friendship Hospital Affiliated of Capital Medical University， Beijing 100050， China

【Abstract】Objectives： To investigate the effect of PMSF on the alive-rate and integrity of DNA double chain in cryopreservation. Methods： The fresh human semen was divided into two groups with PMSF cryoprotectant in one group. Semen in both groups were stored in refrigerators of 4℃， to compare the alive-rate and integrity of DNA double chain after Cryopreservation method. Results： （30m-120h in cryopreservation， using free-cryopreservation） The average alive-rate and non-integrity of DNA double chain of the human semen in experimental group were： （73.2±2.74） %， （67.3±2.56） %， （56.5±2.42） %， （47.4±2.18） %， （41±2.58） %， （30.8±2.64）%；（7.3±1.35） %， （13.8±1.26） %， （16.3±1.56） %， （25±1.36） %， （34.2±1.34） %， （39.2±1.52） %；（30m-120h in Cryopreservation method， using PMSF）. The average alive-rate and non-integrity of DNA double chain of the human semen in experimental group were： （73.2±2.36）%，（70.2±2.68）%，（59.8±2.46）%，（51.2±2.68）%、（44.5±2.95）%，（33±2.89）%；（7.3±1.45）%，（11.5±1.64）%，（14.3±1.68）%，（22±1.58）%，（30.8±1.65）%，（35.7±1.87）%. Conclusion： The differences of alive-rate and integrity of DNA double chain of the human semen are of statistic significance. PMSF is optional in the cryopreservation of human semen. When using the PMSF， the best protective effect only lasts for 48 hours， and as time goes on， the alive-rate will decrease while the incidence of non-integrity of DNA double chain goes up， with no alive-rate after 120 hours.

【Key words】Cryopreservation method； Spermatozoa； Cryoprotectant； PMSF

【中图分类号】R318.52【文献标志码】A

精液冷冻与低温保存，以及人工授精是目前治疗男性不育症，以及进行生殖生物学、胚胎学、遗传学研究的重要手段[1]。在体温状态下，精子的代谢正常，当温度降低时[2]，精子的代謝活动减慢，当温度降至0～5℃，精子的代谢较弱，几乎处于休眠状态。此时精子的物质代谢和能量代谢均降到较低水平，废物累积减少，且此温度下不利微生物的繁殖，故可达到保存目的，但低温同时会导致精子受损[3]。现有研究证实精子的活动率及其DNA双链完整率已成为评价男性生育能力的重要参数[4]，人类精子冷冻及低温保存的方法，及其中加入保护剂的选择成为影响精子各参数的重要因素[5]。现在应用比较广泛的为添加蔗糖的甘油复合型保护剂。现有一些家畜的精子保存实验中加入PMSF，观察其保护作用。作为一种抑制丝氨酸蛋白酶和巯基蛋白酶的抑制剂[6]，有研究发现PMSF可能会保护DNA，在DNA的降解过程中抑制DNA酶的作用。为此，本实验以人类精液为对象，探讨了PMSF对低温保存精子的保护作用。

1材料与方法

1.1实验对象

收集我院泌尿男科门诊2013年10月至2014年2月精液样本共120例。患者均为身体健康，年龄24～38岁，禁欲5～7d留取标本。标本选择标准：外观为半透明的乳白色，pH值为7.2～7.8，液化时间<30min，精子活动力>50%，精子活率>70%，无白细胞和红细胞。符合上述标准标本80例，每例分为2等份进行不同处理后检测精子活率和DNA不完整率。

1.2实验仪器及材料

实验仪器：移液器、荧光显微镜、光学显微镜、表、面皿、温箱、4℃冰箱等。

实验试剂：PMSF购于Sigma公司，吖啶橙购于Amresco公司，伊红染液为国产分析纯产品。

1.3方法

精液标本处理：用移液器取5μL精液于试管中，用生理盐水作50倍稀释，置于37℃温箱之中5min，之后加入PMSF（40μg/mL）于精液试管中，置于4℃冰箱内冷藏。

精子活率检测：分别在30min，24、48、72、96、120h将稀释的精液取10μL于一试管、混匀、再加入10μL伊红染液染色2min，涂片后于光学显微镜[7]下计数300个精子，死精子红染，无色的则为活精子（如图1），计算每份标精子活率。

精子DNA双链完整性的检测：分别在30min，24、48、72、96、120h用移液器取稀释好的精液5μL，用生理盐水洗涤精子2次，弃上清，调整适当精子浓度，涂片。晾干后，用96%乙醇-丙酮按1∶1的比例在4℃冰箱内固定30min。之后在室温下，用70%、80%、90%、无水乙醇逐级脱水，各1min。脱水后用PBS缓冲液进行洗涤，洗涤后将片子放入60℃水浴锅中加入盐酸进行酸化2min之后用蒸馏水洗净，再放入Mcilvain液中5min，取出片子放入0.1mM的吖啶橙染液中1min，之后再用0.001mM吖啶橙染液洗2次，并用双蒸水（ddH2O）洗涤1次。晾干后，用荧光显微镜检测。镜下呈绿色的为DNA双链完整的精子，黄色的则为DNA双链不完整的精子[8]（如图2），每份精子样品计数300个精子，共计数80份，之后算出DNA双链不完整的精子的百分率。

1.4统计学分析

采用SPSS11.5统计软件进行统计学分析，检测数据用均数±标准差表示，组间比较采用配对t检验和相关分析，以P≤0.05作为具有统计学差异。

2结果

低温保存30min～120h之内，精子活率和DNA双链不完整率的差别有统计学意义（P<0.01），而加入PMSF冷冻保护剂组与无PMSF冷冻保护剂相比，差异无统计学意义（P>0.05）；加入PMSF冷冻保护剂与不加入保护剂相比，其对精子的保护不起明显作用，不加入PMSF冷冻保护剂也可达到预期效果，且方法更加简便易行。见表1、表2。

3讨论

目前，液态保存与冷冻保存成为精液保存的主要方法[9]。常温及低温保存为液态保存的主要形式，常温保存不需要特殊设备，简单易行，便于普及和推广。低温保存的温度是0～5℃。一般用冰箱或冰块作冷源，操作简便，保存时间长于常温保存。精液冷冻保存[10]，利用液氮容器存贮、运输，适于精液的长期保存，该方法是用甘油作为冷冻保护剂，将精液置于-196℃液氮中[11]，是比较理想的一种保存方法。本实验所采用的低温保存方法，从数据上可以看出，保存的最佳有效时间仅为2天，故如果只需保存1～2d精液，可以选择此保存方法，但若要长期保存最佳选择还是液氮冷冻保存法。

精子的冷冻和复苏过程中会导致细胞内冰晶的形成，这可破坏精子的超微结构[12]。近年来，研究人员不断尝试新的冷冻方法及保护剂的研究， 如卵黄缓冲液、乙基淀粉、蔗糖、葡萄糖等保护剂[13]，但效果较好的还是经典的甘油复合型保护剂。甘油为渗透性冷冻保护剂，因其分子量小易于进入细胞内起到保护作用，从而使结晶过程延缓，缓解冷冻过程中出现的渗透压效应等，但低浓度的甘油也存在毒性作用[14]。本实验中所采用的PMSF冷冻保护剂，它作为一种核酶抑制剂，可以抑制核酶对细胞核的损伤，但我们的结果表明，在同样的条件下加入PMSF冷冻保护剂同不加入PMSF冷冻保护剂进行低温保存相比，精子的平均活率和DNA双链不完整率的差异无统计学意义，说明PMSF冷冻保护剂在人类精子低温保存中不起明显的作用，结果显示PMSF能保护精子核DNA完整性的时间较短，在30min以后保护作用不明显，其原因可能是PMSF在水液体溶液中不稳定，30min就会降解一半[15]，必须在每一步分离与纯化过程中加入新鲜的PMSF，因而后期对低温保存没有明显影响。

4结论与展望

由我们的结果可以看出，加入与不加入PMSF冷冻保护剂对于精子的平均活率及DNA双链完整性的差异是没有统计学意义的，两种方法的效果差不多，但如果需要短期对精液进行保存，尤其是1～2d内的保存，可以选择加入PMSF冷冻保护剂的方法进行低温保存。

相信随着人类科学技术的不断进步，通过不断的实验，科学实验者们会发现更好的保存精液的方法以及起最佳保护作用的保护。

参考文献

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（收稿日期：2014-01-06）