脂联素在牙周炎致病机制中的初步研究

材料和方法

一、主要试剂仪器

DMEM培养基，胎牛血清，（青链霉素混合液），胰蛋白酶—EDTA，Trizol总RNA提取试剂，二甲基亚砜，eDNA逆转录试剂盒，引物（上海生物工程有限公司），RT—PCR试剂盒。超净工作台，生物光学显微镜，C02孵箱，电子分析天平，全自动酶标仪，Gene CydeTMPCR仪。

二、细胞的培养与鉴定

收集18—25岁身体健康志愿者新鲜拔出阻生齿，在术中收集新鲜且色形质正常的牙龈组织，进行原代培养，培养液为含20%小牛血清的DMEM，在37℃、5%C02和饱和湿度条件下培养。当从组织块中游出的细胞铺满瓶底约80%时进行首次传代，第4—5代细胞用于实验。

三、P.g LPS与APN单独刺激以及联合刺激HGFs

取5代HGFs以1×105个/孔的密度均匀铺在12孔板上，于37℃、5%CO2温箱孵育2天使细胞贴壁融合至80%时，更换为1%FBS的DMEM培养基培育1天（这一步作为饥饿处理使牙龈成纤维细胞在刺激因素干预后产生足量的细胞因子），1天后开始刺激实验，P.g LPS与APN单独刺激或两者联合刺激HGFs6h。根据组别在12孔板每孔依次加入2μg/ml P.g LPS 2ml，1μg/ml APN 2ml，2ptg/mlP.g LPS 2ml+1μg/ml APN 2ml，空白对照（10%FBS培养基）2ml，每组设置3个复孔，于37℃，5%CO2温箱孵育24h，弃去培养液，于加药后6h提取HGFs的总mRNA。

四、实时荧光定量PCR检测基因表达水平

使用Trizol法提取上述中HGFs的总mRNA，并读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，以测定RNA溶液浓度和纯度。总mRNA遵循cDNA逆转录试剂盒（美国Sigma公司）操作程序，进行逆转录反应，合成第一链cDNA。使用RT—PCR试剂盒，按照制造商的说明编写热循环程序，对第一链cDNA进行real—time PCR热循环反应，引物序列参见表1。

五、统计学分析

用2—△△ct法处理数据，与对照组比较，用IBM SPSS Statistics23.0统计软件进行数据分析，结果均采用x±s表示，组间比较采用单因素ANOVA方差分析（完全随机设计），以P<0.05显示组间差异有显著差异即有统计学意义。

结果

P.g LPS与APN单独刺激以及联合刺激HGFs分泌炎性介质的影响情况

讨论

细菌及其产物作为牙周病的主要始动因子，是诱发牙周病的主要病因，而格兰氏阴性厌氧菌作为牙周病的主要致病菌，在牙周炎患者的深牙周袋与龈沟液中常有较高的检出量，而P.g作为细菌红色复合体的一员可以说是格兰阴性厌氧菌中最具代表性的一员。脂多糖（LPS）作为其上特有的一种致病物质，对牙周组织有很高的毒性，被认为是牙周炎症的主要病因之一，大量研究表明，P.g LPS可以诱导不同类型的细胞产生大量的细胞因子。此外本实验选取体外培养的健康人牙龈成纤维细胞这一牙周组织的基石细胞来作为模式细胞，也是基于国内外学者研究的基础。在阅读了大量前人的相关文献后，最终本实验通过2ug/mlP.g LPS来刺激人牙龈成纤维细胞模拟体外牙周炎模型，其中P.g LPS浓度的确定依据相关文献及前期预实验的相关结果（未展示），提示在2ug/mlP.g LPS刺激下人牙龈成纤维细胞分泌目标因子IL—6、COX—2和IL—10作用较强，而正式实验中也证实了2ug/mlP.g LPS刺激组与空白对照组相比可以明显促进促炎因子IL—6和COX—2的表达（P<0.005），但却抑制了抗炎因子IL—10的表达（P<0.005）。研究表明P.gLPS作为牙周病、尤其是慢性牙周炎病变区或活动部位主要的优势菌所独有的一类高度活性的致病物质，对牙周组织具有很高的毒性和抗原性，因此利用P.gLPS用于体外构建牙周炎模型。许多研究表明NFκB是一种重要的炎症反应转录因子，健康状况下，未被激活的NF—κB转录因子由其抑制蛋白IκB将其保持在胞质中，炎症状态下IκB磷酸化部分分解，NF—κB易位至细胞核，激活一些炎性因子基因的表达。脂联素与其结合后可激活受体位于膜内的N端，使其与一种称为APPL1的接头蛋白相连接，从而介导下游包括如腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）、P38丝裂原活化蛋白激酶（P38MAPK）、过氧化物酶体增殖物激活受体—α（PPAR—α）、核转录因子—κB（NFKB）、RAS相关蛋白Rab5、胞内磷脂酰肌醇3—激酶（P13K）和Akt等信号途径。Yamaguchi N的研究发现人牙龈成纤维细胞表达AdipoR1和Adi-poR2，我们的前期实验也证实了这一点：在人牙龈成纤维细胞上有AdipoR1和AdipoR2的表达（结果未展示）。关于APN在牙周炎症反应中的作用机制目前尚无定论，有研究表明，APN在与脂联素受体上的羧基末端结合后，吸引大量APPL1至脂联素受体的氨基末端，之后活化AMPK通路，而活化的AMPK通路又会抑制IKK—NF—kB通路，因此，从这个意义上来说，APN主要是通过减少NF—kB向核内转录，从而抑制LPS诱导的炎症因子的表达。但也有研究表明高分子脂联素通过AdipoR1抑制NF—κB的表达，延缓IκB的易位，从而抑制炎性因子的产生。此外也有学者发现球状脂联素能够诱导人外周巨噬细胞分泌IL—6和TNF—α，在LPS的作用下，高分子量多聚体脂联素能增加趋化因子IL一8的翻译和巨噬细胞对晚期凋亡细胞的吞噬。我们的研究表明与空白对照组，APN明显抑制HGFs分泌促炎因子白介素—6与环氧酶—2（COX—2）（p<0.05），促進HGFs分泌抗炎介质白介素—10（p<0.05）；APN对P.g LPS刺激HGFs分泌炎性介263.质的影响，与空白对照组相比，P.g LPS显著促进HGFs分泌促炎因子IL—6，COX—2，APN对这一作用起抑制效应（p<0.005）。与空白对照组相比，P.g LPS显著抑制HGFs分泌IL—10（P<0.005），而APN明显拮抗这一作用（P<0.005）。

综上所述，牙龈成纤维细胞受到P.g LPS刺激后能合成分泌多种细胞炎症因子发挥免疫炎症反应，同时P.g LPS可以作为牙周炎体外模型的高效诱导剂。APN可抑制HGFs分泌促炎因子IL—6与COX—2，促进分泌抗炎因子IL—10发挥抗炎作用，APN可通过调控促炎因子和抗炎因子在牙周炎的发生发展中发挥抗炎作用。