巴戟天醇提物对D—半乳糖致衰老大鼠免疫功能的影响

[摘要] 目的 探讨巴戟天醇提物对D-半乳糖致衰老大鼠免疫功能的影响。 方法 50只健康雄性Wistar大鼠随机均分为空白对照组、模型对照组、维生素E组、巴戟天高剂量组和巴戟天低剂量组，每组各10只。利用D-半乳糖制作衰老大鼠模型，并用维生素E及两种不同剂量的巴戟天醇提物进行灌胃。给药结束后，检测大鼠的胸腺指数、脾脏指数、T淋巴细胞转化指数、B淋巴细胞转化指数、白介素-2（IL-2）水平以及CD28阳性淋巴细胞数。 结果 与模型对照组比较，维生素E组、巴戟天高剂量组和巴戟天低剂量组胸腺指数、脾脏指数、T淋巴细胞转化指数、B淋巴细胞转化指数、IL-2水平以及CD28阳性淋巴细胞数明显升高，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。 结论 巴戟天醇提物能够增强D-半乳糖致衰老大鼠的免疫功能，可能具有延缓衰老的作用。

[关键词] 巴戟天醇提物；D-半乳糖；免疫功能；刺激指数；白介素-2；CD28

[中图分类号] R393 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）02（a）-0017-03

近年来，我国人口老龄化趋势明显呈上升趋势，随之而来的因衰老引起的社会和医学问题严重困扰着广大学者，因此，关于如何延缓衰老的问题成为了目前生命科学工作者所关注的热点。研究表明，衰老是机体随着年龄的增长而出现的多种器官、组织等发生的退行性改变，属于一种自然生理现象，衰老的形成受多种因素的影响，机体所表现出来的体征等也多种多样，例如行动迟缓、记忆力下降以及免疫功能降低等[1]。

巴戟天最早是作为一种壮阳中药应用于一些基础研究和临床的，后来研究发现其具有补肾壮阳、增强性欲、抗肿瘤、缓解抑郁症状以及抗衰老等多种作用，作为提取自巴戟天的巴戟天醇提物也具有类似的作用[2-3]。以往的研究证实，巴戟天醇提物通过抗氧化以及抗凋亡而发挥其抗衰老作用的[4]，而关于其对衰老大鼠免疫功能的影响尚未有报道。因此，作者旨在通过将巴戟天醇提物应用于D-半乳糖致衰老大鼠模型来探讨其对衰老大鼠免疫功能的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂

巴戟天醇提物提取自巴戟天（一等品，广东省德庆县药材公司，河南省食品药品检验所鉴定）；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、刀豆素（canavalin，ConA）（批号：20120203、201200123，美国Sigma公司）；大鼠白介素-2（IL-2），定量酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（批号：20120417，美国RD公司）；PE-兔抗大鼠CD28单抗（批号：12-0280-81，美国eBioscience公司）；考马斯亮兰试剂盒（批号：20120509，南京建成生物工程研究所）。

1.2 仪器

CASTEAX2100型全自动酶联免疫分析仪（美国Beckman公司）；FACSCalibur流式细胞仪（美国Becton Dicknson公司）。

1.3 实验动物

健康雄性Wistar大鼠，4月龄，体重200～245 g，平均（223±12）g，由河南省实验动物中心提供。

1.4 分组及处理

50只大鼠随机均分为空白对照组、模型对照组、维生素E组、巴戟天高剂量组、巴戟天低剂量组，每组各10只，各组大鼠常规分笼饲养。模型对照组及巴戟天高、低剂量组大鼠均每天皮下注射质量分数5%D-半乳糖1 mL/kg；空白对照组大鼠均每天皮下注射质量分数0.85%氯化钠溶液1 mL/kg；维生素E组大鼠每天在给予D-半乳糖的同时，给予维生素E 50 mg/（kg·d）灌胃；巴戟天高、低剂量组大鼠在每天给予D-半乳糖的同时，分别给予巴戟天醇提物2.1、0.7 g/（kg·d）灌胃。所有大鼠均连续给药8周，之后进行免疫功能相关指标的检测。

1.5 大鼠脏器指数的检测

首先对每只大鼠进行称重，并记录，然后常规解剖，无菌条件下取出脾脏、胸腺进行称重，计算脏器指数，公式如下：脾脏指数或胸腺指数=（脾脏重量或胸腺重量/大鼠体重）×100%。

1.6 淋巴细胞转化试验

末次给药后次日，将取出的部分脾脏制成脾细胞悬液，调节细胞浓度至1×107/mL，然后加入96孔培养板，每孔200 μL，再加入20 μg/mL ConA（用于T淋巴细胞转化试验）或LPS（用于B淋巴细胞转化试验），并设对照孔以及ConA刺激孔或LPS刺激孔。置于37℃、5% CO2培养箱中孵育72 h，并采用MTT法测定570 nm处OD值，根据OD值计算T、B淋巴细胞刺激指数，计算公式如下：刺激指数（SI）=（刺激孔OD值/对照孔OD值）×100%。所有实验重复3次，每次设3个复孔。

1.7 IL-2表达检测

末次给药后次日，将取出的部分脾脏与0.85%氯化钠溶液制成10%脾脏组织匀浆，采用双抗夹心ELISA法定量检测IL-2，具体操作步骤参考试剂盒说明书。

1.8 CD28表达检测

末次给药后次日，从取出的脾脏中取1 mm3脾脏组织剪碎，制成脾细胞悬液，取脾细胞悬液100 μL用红细胞裂解液裂解红细胞直至液体变成无色透明，然后3 000 r/min离心3 min，磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤2次，调脾细胞浓度至2×106/mL，取其中40 μL加入试管，同时往试管中加入异硫氰酸荧光素（FITC）标记的CD28单抗10 μL，震荡混匀，并于4℃冰箱中孵育30 min，PBS洗涤，3 000 r/min离心3 min，然后细胞定容至0.5 mL到专用试管，上流式细胞仪进行CD28阳性淋巴细胞检测。

1.9 统计学方法

采用统计软件SPSS 17.0对实验数据进行分析，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 巴戟天醇提物对大鼠脏器指数的影响

模型对照组胸腺指数、脾脏指数明显低于空白对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）。与模型对照组比较，维生素E组、巴戟天高剂量组和巴戟天低剂量组胸腺指数、脾脏指数明显升高，差异有统计学意义（P < 0.05）。维生素E组、巴戟天高剂量组胸腺指数、脾脏指数比较，差异无统计学意义（P > 0.05）；巴戟天低剂量组胸腺指数、脾脏指数低于维生素E组、巴戟天高剂量组，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。见表1。

2.2 巴戟天醇提物对大鼠淋巴细胞的影响

模型对照组T淋巴细胞转化指数、B淋巴细胞转化指数明显低于对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）。与模型对照组比较，维生素E组、巴戟天高剂量组和巴戟天低剂量组T淋巴细胞转化指数、B淋巴细胞转化指数明显升高，差异有统计学意义（P < 0.05）。维生素E组、巴戟天高剂量组T淋巴细胞转化指数、B淋巴细胞转化指数比较，差异无统计学意义（P > 0.05）；巴戟天低剂量组T淋巴细胞转化指数、B淋巴细胞转化指数低于维生素E组、巴戟天高剂量组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表2。

2.3 巴戟天醇提物对大鼠IL-2及CD28的影响

模型对照组IL-2水平以及CD28阳性淋巴细胞数明显低于对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）。与模型对照组比较，维生素E组、巴戟天高剂量组和巴戟天低剂量组IL-2水平以及CD28阳性淋巴细胞数明显升高，差异有统计学意义（P < 0.05）。维生素E组、巴戟天高剂量组IL-2水平以及CD28阳性淋巴细胞数比较，差异无统计学意义（P > 0.05）；巴戟天低剂量组IL-2水平以及CD28阳性淋巴细胞数低于维生素E组、巴戟天高剂量组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表3。

3 讨论

衰老的发生机制众多，诸如自由基过剩导致衰老理论、衰老的细胞凋亡学说、衰老的免疫功能障碍学说等，随着衰老相关机制的研究进展，衰老的免疫学说的地位越来越高。越来越多的研究表明，免疫功能下降是机体出现衰老的征兆和重要因素[5-6]，随着增龄化的进展，机体免疫器官老化，免疫细胞、免疫相关因子的数量和功能发生明显变化，从而导致了感染性疾病、恶性肿瘤、自身免疫性疾病的发病率上升。D-半乳糖是一种常用的致衰老药物，其制作的模型已经被广泛应用于实验研究。研究表明，D-半乳糖致衰老模型其各种免疫功能相关指标的变化与自然衰老一致[7]，例如免疫器官老化、淋巴细胞转化能力减弱、机体IL-2水平降低、胸腺指数及脾脏指数降低等。因此，本研究选择D-半乳糖致衰老模型代替自然衰老模型是切实可行的。本研究结果也提示，D-半乳糖能够降低大鼠胸腺指数、脾脏指数，T、B淋巴细胞SI，IL-2水平，以及体内CD28阳性淋巴细胞数量，进一步验证了机体免疫功能的衰退是导致衰老发生的重要因素。

胸腺是免疫调节的中枢器官，主要用于为T淋巴细胞的分化、成熟提供场所，对于机体的细胞免疫功能以及免疫反应的发生具有重要作用。而脾脏是最大的外周免疫器官，其为各种成熟的淋巴细胞提供定居场所以及发生免疫应答。胸腺和脾脏均会随着机体的增龄化进程，质量变轻，功能下降[8]。本研究结果提示，高、低剂量的巴戟天醇提物与阳性对照药物维生素E相似，均具有提高衰老大鼠脏器指数的作用，且两种剂量的巴戟天醇提物的作用不同，低剂量者作用较弱（P < 0.05）。

T、B淋巴细胞在机体发生特异性免疫应答中发挥重要作用。其中T淋巴细胞主要介导细胞免疫，其杀伤作用及分泌免疫相关因子能力的下降导致机体自身免疫性疾病、恶性肿瘤等发生，随着年龄的增大，T淋巴细胞的数量和功能均会下降[9]。B淋巴细胞主要参与机体的体液免疫，通常通过分泌细胞因子进行免疫调节，且这种分泌作用于年龄的增长呈负相关[9-10]。本组实验结果提示，巴戟天醇提物与维生素E一样能够有效提高衰老大鼠降低的T、B淋巴细胞转化能力，从而促进这些细胞的增殖，且巴戟天高剂量组作用强于低剂量组（P < 0.05）。

IL-2主要由活化的T淋巴细胞分泌，特别是辅助性T淋巴细胞分泌能力更强。IL-2具有较强的免疫调节作用，能够促进T淋巴细胞的增殖、分化，增强T淋巴细胞及NK细胞的活性，同时还可以通过促进干扰素合成而增强细胞杀伤力。IL-2随年龄增加分泌减少被认为是衰老的免疫学说的主要分子机制[11]。本实验结果显示，巴戟天醇提物与维生素E一样能够提高衰老大鼠IL-2表达水平，从而促进T淋巴细胞及NK细胞的的增殖及杀伤作用等，且巴戟天高剂量组作用强于低剂量组（P < 0.05）。

CD28分子是广泛表达于T淋巴细胞表面的共刺激分子，为T淋巴细胞的活化提供第二信使，从而发挥重要作用[12]。另外，CD28还参与免疫维持及下调免疫功能，在免疫功能平衡与稳定过程中发挥重要作用。随着机体的老化，CD28分子信号转到能力下降，进而导致T淋巴细胞的增殖活化受阻，同时IL-2等细胞因子分泌减少，以致机体的细胞免疫和体液免疫均呈现衰退和紊乱，这也导致了机体的衰老[13]。本组结果显示，巴戟天醇提物与维生素E一样能够提高衰老大鼠CD28阳性淋巴细胞数量，且巴戟天高剂量组作用强于低剂量组（P < 0.05）。

综上所述，巴戟天醇提物能够下调D-半乳糖致衰老大鼠的胸腺指数、脾脏指数，T、B淋巴细胞转化能力，IL-2水平，以及CD28阳性淋巴细胞数量，从而提高衰老机体的免疫力，可能具有一定的延缓衰老的作用。

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（收稿日期：2012-09-17 本文编辑：李继翔）