反义结缔组织生长因子对人瘢痕疙瘩成纤维细胞的作用

[摘要]目的： 研究结缔组织生长因子(CTGF)反义寡核苷酸(ASODN)对人瘢痕疙瘩成纤维细胞CTGFmRNA的表达和细胞增殖及胶原合成的影响，探讨瘢痕疙瘩的基因治疗。方法：体外分离、培养人正常皮肤成纤维细胞(NSF)和瘢痕疙瘩成纤维细胞(KF)，以脂质体介导方法将CTGFASODN转染KF中，用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法检测细胞中CTGFmRNA的表达；采用MTT方法测细胞增殖；3H-脯氨酸掺入法检测细胞的胶原合成量。 结果：CTGFmRNA在NSF中几乎无表达，在KF中表达增高，CTGFASODN可以抑制其增殖和胶原合成(P<0.05)。结论：CTGFASODN能够抑制成纤维细胞CTGFmRNA表达和细胞增殖及胶原合成，表明阻断CTGF可能是延缓瘢痕纤维化的有效手段。

[关键词]结缔组织生长因子；反义寡核苷酸；瘢痕疙瘩

[中图分类号]R619+.6[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2011）06-0936-03

Effects of connective tissue growth factor antisense oligonucleotides on the cultured human keloid fibroblasts

REN Li-hong1, DUAN Guo-xin2, YANG Da-ping1, LIU Ying1, XIAO Zhi-bo1, TENG Wen1, LIU Guo-feng1

（1.Plastic Cosmetic Center,The Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University,Harbin 150086,Heilongjiang,China; 2.Department of Plastic Surgery,Shengmeijia Plastic Surgery Clinic,Shenzhen 518000,Guangdong,China）

Abstract:ObjectiveTo explore the effects of connective tissue growth factor(CTGF) antisense oligonucleotides on the expression of CTGF mRNA, cell proliferation and collagen synthesis in the cultured human keloid fibroblasts. MethodsNormal skin fibroblasts(NSF) and keloid fibroblasts(KF) were cultured in vitro, CTGF antisense oligonucleotides were transfected into the KFs by liposome. The expression of CTGFmRNA was assessed by reverse transcription polymerase chain reaction method(RT-PCR).Cell proliferation was detected by MTT method and the collagen synthesis of KF was assessed by 3H-proline incorporation method.ResultsCTGFmRNA was strongly expressed in KF(P<0.05), whereas it was not expressed in NSF. CTGF antisense oligonucleotides could inhibited CTGFmRNA expression, cell proliferation and collagen synthesis.ConclusionsCTGF antisense oligonucleotides could inhibited the expression of CTGFmRNA, cell proliferation and collagen synthesis, implying that CTGF may be a potential therapeutic target to scar fibrosis.

Key words: connective tissue growth factor; antisense oligonucleotides; keloid

瘢痕疙瘩(Keloid)是以成纤维细胞为主的细胞成分过度增殖和以胶原为主的细胞外基质过度沉积的皮肤纤维化疾病[1]，目前其发病机制尚不十分清楚。结缔组织生长因子(CTGF)是转化生长因子β1(TGF-β1)的下游效应因子，是一个重要的促纤维化细胞因子[2]，其过度表达与某些纤维化性疾病的发生、发展密切相关，如硬皮病、肾纤维化、肝纤维化、肺纤维化、动脉粥样硬化等[3-4]。

反义寡核苷酸能以序列特异方式抑制基因表达，在治疗癌症、微生物感染、自身免疫病等方面取得了可喜成绩。本研究通过体外培养人瘢痕疙瘩成纤维细胞(KF)观察CTGF反义寡核苷酸（ASODN）对CTGFmRNA的表达，成纤维细胞增殖及胶原合成的影响，探讨CTGF在瘢痕纤维化中可能的作用。

1材料和方法

1.1标本取材：取自哈医大二院整形美容科手术标本，包括正常皮肤4例，瘢痕疙瘩10例。男8例，女6例；年龄16～37岁；瘢痕增生的时间在3～6个月。

1.2试剂和材料：RPMI1640培养液、新生胎牛血清（美国Hyclone公司）；Dotap脂质体（美国Biontex公司）；TRIzol Reagent、 RT-PCR试剂盒（美国Invitrogen公司）；MTT（美国Sigma公司）；3H-脯氨酸（中国原子能核物理所）；液闪测定仪（美国Beckman公司）。

1.3CTGF ASODN的合成：CTGF反义寡核苷酸碱基序列为：5，-TACTGGCGGCGGTCAT-3，[5],实验前进行全硫代化修饰及5，-异硫氰酸荧光素(FITC)标记，由上海生工生物工程公司合成。

1.4组织块成纤维细胞培养：将手术中切下的正常皮肤、瘢痕疙瘩组织在无菌条件下去除表皮后用PBS漂洗3次，用眼科剪剪成约1mm3的碎块，采用组织块贴壁法培养于含10%胎牛血清的RPMI1640培养液中，置37℃，5%CO2条件下原代培养。每2天换一次培养液。待细胞接近80%融合时，经0.25%的胰蛋白酶消化传代。在传代至3～5代时进行分析。实验分三组：①正常皮肤成纤维细胞(NSF)；②瘢痕疙瘩成纤维细胞(KF)；③KF+CTGF ASODN。

1.5细胞转染：采用无血清、无抗生素的RPMI1640培养液分别稀释CTGF ASODN和Dotap脂质体，室温下静置30min后等量混匀，即形成反义ODN-脂质体复合物。向第3组滴加入ASODN-脂质体复合物(两者终浓度为20μg/ml[5])继续培养，胎牛血清的体积分数改为5%，其余条件同前。

1.6逆转录-聚合酶链式反应：于转染后48h按照TRIzol说明书在培养瓶中提取总RNA，1%甲醛琼脂糖变性凝胶电泳检测RNA样本的完整性良好，并用RNA/DNA计算器检测RNA的浓度。取RNA2.0μg作逆转录，反应条件为70℃10min,37℃60min，99℃5min.取1μl逆转录产物为模板，三磷酸甘油醛脱氢酶(G3PDH)为外参照，将CTGF与G3PDH同等条件扩增。预期CTGF的扩增片段长度微766bp，上游引物为5，-GCCCAGACCCAACTATGA-3，下游引物为5，-ACCCTCCCAC TGCTCCTA-3，；G3PDH的扩增片段长度为450bp，上游引物为5，-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3，下游引物为5，-TCCACCACCCTG TTGCTGTA-3，。反应条件为：94℃预变3min、94℃变性40s、56℃退火 40s、72℃延伸40s，共循环30次,72℃延伸10min。取PCR产物5μl在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，用凝胶成像系统观察结果并照相，用计算机图象处理系统分析，计算目的基因、G3PDH基因条带相对吸光度。

1.7MTT法测成纤维细胞增殖每孔5×103个细胞接种于96孔培养板上，每组做三孔，取平均值。分别于转染6、12、24、48、72h取出一块培养板，用MTT法测定各孔光吸收值，以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生长曲线。

1.83H-脯氨酸掺入法测成纤维细胞胶原蛋白合成：瘢痕疙瘩成纤维细胞1×104个/孔分种于24孔培养板上，于转染48h后吸弃上清液，加入3H-脯氨酸继续培养10h，多孔收集器收集细胞于玻璃纤维纸上，液闪测定仪闪烁记数测定3H-脯氨酸掺入量。每组设3个复孔。

1.9统计学分析：采用SPSS 10.0统计软件包，对各实验组数据进行单因素方差分析。

2实验结果

2.1 逆转录-聚合酶链式反应结果：CTGFmRNA在NSF组中表达极弱，在KF中表达增强，ASODN组CTGFmRNA表达减弱(图1)。CTGFmRNA的表达量经方差分析，CTGF ASODN组表达量（0.28±0.62）显著低于KF组（0.74±0.16），差异有显著性意义（P<0.05）。

2.2 CTGFASODN对成纤维细胞生长曲线的影响：NSF组、KF组曲线逐渐升高，其中KF组升高幅度明显大于NSF组；而KF+CTGFASODN组在转染后第6h生长曲线明显呈下降趋势，至72h降至最低（见图2）。

2.3 CTGFASODN对KF胶原合成的作用：利用3H-脯氨酸掺入，在无血清培养的条件下，观察CTGFASODN对KF胶原合成的影响。其中，KF组中胶原合成量（5891±182）明显较NSF组（1367±218）增多 (P<0.05)；而CTGFASODN对KF胶原合成（3487±629）有明显抑制作用,差异有显著性意义(P<0.05)。

3讨论

在许多纤维化疾病中CTGF与TGF-β1的表达同步增高[6]。Grotendorst等[7]发现，在CTGF启动子-162～-128核苷酸序列中有一个TGF-β1反应元件，其点突变可以导致TGF-β1活性完全丧失，故认为CTGF是TGF-β1致纤维化作用的直接下游效应介质。

反义寡核苷酸技术是根据核酸间结合需遵循碱基互补原则这一原理，使用与目的基因特定互补的短核苷酸片段阻断目的基因的表达。脂质体具有安全、高效、使用方便和无免疫原性等优点，可以使细胞摄取寡核苷酸的能力增加10～20倍。

研究结果显示，从mRNA水平看，CTGF在正常皮肤成纤维细胞中表达极其微弱，在瘢痕疙瘩成纤维细胞中表达增高，因此我们推测在瘢痕疙瘩纤维进程中，可能伴随着CTGF DNA向mRNA转录过程的启动以及高水平转录的持续存在，进而翻译成CTGF蛋白质，后者发挥生物学活性刺激组织中成纤维细胞增殖和外基质合成增加，增殖的成纤维细胞又产生更多的CTGF，这样恶性循环，最终形成大量的纤维化组织，导致瘢痕形成。

MTT是一种淡黄色唑氮盐，是线粒体脱氢酶的作用底物，经活细胞内线粒体脱氢酶的消化作用，被还原成不溶于水的蓝紫色form azan的结晶。结晶溶解后，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定光吸收值，来反映细胞的增殖能力和存活情况。体外培养的KF的MTT生长曲线结果显示CTGFASODN能明显抑制瘢痕成纤维细胞的增殖活性，表现为生长曲线逐 渐下降。

胶原蛋白是细胞外基质中最活跃的成分之一，是创面愈合和瘢痕形成的关键因素，胶原蛋白的异常合成与沉积是病理性瘢痕的基础。可以通过检测3H标记的脯氨酸掺入胶原的量来分析胶原合成速度，3H-脯氨酸掺入结果显示，CTGFASODN能够抑制体外培养的KF合成胶原。

由于RT-PCR证实ASODN转染后KF中CTGFmRNA表达水平较KF降低，证明CTGFASODN抑制KF增殖并抑制其胶原合成，均是由于其有效的抑制了KF内CTGF的基因转录，说明CTGF ASODN成功地发挥了其反义抑制作用。

许多年以来， TGF-β1被认为是促进瘢痕纤维化的最重要的生长因子之一[8]，但他同时也是一种有效的免疫调节剂，具有抗炎等重要生物学活性，研究表明新生小鼠敲除TGF-β1基因，在出生后很快死于全身炎症，鉴于TGF-β1作用的靶细胞种类繁多、生物学效应复杂，因此完全阻断其表达或活性的后果是难以预料的[9-11]。相比之下，CTGF作为TGF-β1的下游效应因子，特异性介导TGF-β1的促纤维化效应，因此，阻断CTGF的生物学效应可能是一条相对安全的延缓瘢痕纤维化的新途径。

[参考文献]

[1]Frank B,Niessen MD,Paul HM, et al. On the nature of hypertrophic scars and keloids: A review[J].Plast and Reconstr Surg,1999,104(5):1435-1449.

[2]Goldschmeding R,Aten J,Ito Y,et al. Connective tissue geowth factor: just another factor in renal fibrosis[J]? Nephrol Dial Transplant,2000,15(3):296-299.

[3]Leask A,Holmes A,Abraham DJ. Connective tissue growth factor : a new and important player in the pathogenesis of fibrosis[J].Curr Rheumatol Rep,2002,4(2):136-142.

[4]Kucich U,Rosenbloom JC,Herrick DJ,et al. Signaling events required for transforming growth factor-beta stimulation of connective tissue growth factor expression by cultured human lung fibroblasts[J].Arch Biochem Biophys,2001,395(1):103-112.

[5]Hishikawa K,Oemar BS,Nakaki T.Static pressure regulates connective tissue growth factor expression in human mesangial cells[J]. J Biol Chem, 2001,276(20):16797-16803.

[6]Chen MM, Lam A, Vidaud M, et al. CTGF expression is induced by TGF-β1in cardiac fibroblasts and cardiac myocytes: a potential role in heart fibrosis[J]. J Mol Cell Cardiol,2000,32(10):1805-1819.

[7]Grotendorst GR,Okochi H,Hagash N,et al. Role of connective tissue growth factor in fibronectin expression and tubulointerstitial fibrosis[J].Am J Physiol Renal Physiol,2002,282(5):933-942.

[8]郝立君,李宜姝,段国新,等. 抗转化生长因子β1预防和治疗瘢痕疙瘩的研究[J].实用美容整形外科杂志,2003,14(5):271-274.

[9]Colwell AS,Phan TT,Kong W,et al. Hypertrophic scar fibroblasts have increased connective tissue growth factor expression after transforming growth factor-beta stimulation[J].Plast Reconstr Surg,2005,116(5):1387-1390.

[10]Wang S,Hirschberg R.BMP7 antagonized TGF-β-dependent fibrogenesis in mesangual calls[J].Am J Physiol Renal Physiol,2003,284(5):1006-1013.

[11]Zhang C,Meng XF,Zhu ZH,et al. Role of connective growth factor in plasminogen activator inhibitor-1 and fibronectin expression induced by transforming growth factor beta1 in renal tubular cells[J]. Chin Med J,2004,117(7):990-996.

[收稿日期]2011-03-26 [修回日期]2011-05-16

编辑/张惠娟

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