铁皮石斛饮片中有机氯及拟除虫菊酯农药多残留检测方法的研究

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摘要 [目的]制定一套成熟的铁皮石斛药材中有机氯及拟除虫菊酯农药多残留检测方法。[方法]在空白铁皮石斛中加入27种有机氯及拟除虫菊酯标品，用水浸润样品，以丙酮和正己烷作为提取溶剂，高速均浆为提取手段，GPC和弗罗里硅土、Carb-NH2柱固相萃取联用作为净化方式，用GC-μECD检测农药残留。[结果]试验得出，建立的分析方法对各个农药的回收率在79.6%～103.1%，重复性在198%～8.26%，符合农药残留检测要求。[结论]研究可为中药材中农药的残留检测方法的制定和完善提供参考依据。

关键词 铁皮石斛；有机氯及拟除虫菊酯；凝胶净化

中图分类号 S481+.8 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2016）07-066-04

Detection Method of Organochlorine and Pyrethroid Pesticide Residue in Dendrobium officinale Slices

HU Qi-jie， ZHU Jia-xi， WANG Xin-cai et al （Huzhou Institute for Food and Drug Control， Huzhou， Zhejiang 313000）

Abstract [Objective] To establish a mature detection method for organochlorine and pyrethroid pesticide residue in Dendrobium officinale slices. [Method] Standard substances of 27 organochlorines and pyrethroid were added into D. officinale. After soaked in water， acetone and n-hexane were used as extraction solvent. With high-speed homogenate as the extraction means， GPC was combined with Florida silica and Carb-NH2 column solid-phase extraction to purify the substances. [Result]GC-μECD detection found out that the recovery rate of each pesticide was 79.6%-103.1% with repeatability being 1.98%-8.26%， which met the requirements of the pesticide residue detection. [Conclusion] This research provides references for the establishment and improvement of pesticide residue detection method in Chinese Herbal Medicines.

Key words Dendrobium officinale； Organochlorine and pyrethroid； Gel purification

農药多残留（Pesticide Residues）是指使用农药之后一定时期内没有被分/降解而残留于生物体内、土壤、水体、大气中的农药原体、降解物和有毒代谢物及杂质的总称。人们食用了被污染的中草药后，残留在其中的农药便会积聚在体内，因其代谢缓慢，最终将导致急性或慢性中毒，产生严重的后果。因此世界各国对此高度重视，欧美等许多国家都对传统药和草药制定了非常严格的农药多残留限量标准。农药多残留检测属于复杂混合物中痕量组分分析技术，中药材农药多残留检测具有以下特点：既需要精细的微量操作手段，又需要高灵敏度的痕量检测技术[1]。农药多残留量检测方法的研究已成为影响中药国际贸易的最重要技术要求之一，严重制约了中药发展的国际化与现代化。因此，研制简单、快速、准确，并可同时定性、定量的农药多残留检测方法是保障人民用药安全，推动中药材现代化建设迫切需要解决的问题之一。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料及主要试剂。

试验采用的铁皮石斛，采购自湖州仁皇山街道康龙保健食品商行。所用水为经过二次蒸馏的重蒸水；丙酮、正己烷、环己烷、乙酸乙酯、二氯甲烷，均为色谱纯，默克公司；27种有机氯及拟除虫菊酯标准品，国家标准物质研究中心；无水硫酸钠，分析纯，麦克林。

1.1.2 主要仪器设备。

GC-μECD（Agilent7890B）；凝胶净化系统GPC、全自动固相萃取仪，莱伯泰科（LAB TECH）公司；高速匀浆机、旋转蒸发仪，德国IKA；氮吹仪，美国Organomation；恒温水浴振荡器，上海精风仪器有限公司；旋涡混匀器（IKAM S1）；高速冷冻离心机，贝克曼。

1.2 方法

1.2.1 样品处理。

提取：称取2 g铁皮石斛过筛粉末于均质杯中，加入6 mL水，充分膨胀，然后加入10 mL丙酮和10 mL正己烷，15 000 r/min均质1 min，离心，然后再用5 mL丙酮和10 mL正己烷均质2次，合并上清液于加有10 mL饱和氯化钠溶液的具塞量筒中，剧烈振荡2 min，静置20 min，分层。

GPC净化：吸取上层有机相过无水硫酸钠，旋转蒸发至5 mL，转移至玻璃管氮吹至近干，加6 mL乙酸乙酯+环己烷（1∶1）溶解。样品过滤至GPC进行净化，收集9.5～17.5 min流出液，40 ℃旋转蒸发至5 mL，转移至玻璃管氮吹至近干，加入2 mL丙酮。

SPE净化：预先用5 mL丙酮+二氯甲烷（1+1）活化Carb-NH2柱，加入待净化液使其逐滴留下，用5 mL×2丙酮+二氯甲烷（1+1）洗脱，收集洗脱液氮吹至近干，加入2 mL正己烷。将弗罗里硅土柱依次用5 mL丙酮+正己烷（1+9）、5 mL正己烷预淋洗，加入上述待净化，用5 mL×2丙酮+正己烷（1+9）洗脱，收集洗脱液氮气吹至近干，用正己烷定容至1 mL。

1.2.2 GC色谱条件。

色谱柱：安捷伦DB-1701（30 m×0.25 mm× 0.25 μm）；进样口温度：200 ℃；检测器温度：320 ℃；柱温程序升温：150 ℃保持2 min，以6 ℃/min升至270 ℃，保持23 min；柱流速：1 mL/min；不分流进样；载气：氮气，纯度≥99.999%[2]。

2 结果与分析

2.1 提取过程加水的考察 该试验考察样品在提取前加不加适量的水来考察提取效果，发现水浸润后提取液澄清透明，因为加入适量的水能增加粉状样品之间的吸附力，经过离心后能完全达到固液分离。不加水，提取后提取液浑浊，并且有粉末和纤维漂浮在上面，从而影响后续的试验。并且加了水能使提取溶剂更好地浸入样品中，从而有利于农药残留的提取[3]。

通过试验发现，不加水各个农药回收率为38.2%～873%，而加水回收率提升到了78.6%～101.8%。因此，在有机溶剂提取样品前应先加入适量的水浸润。

2.2 提取溶剂的选择 样品前处理的提取方法是影响到整个试验成功的关键因素，选择提取溶解有2个关键因素：第一是将痕量农药残留完全从样品中提取出来，第二是尽量少地溶解出杂质。根据有机氯及拟除虫菊酯的理化性质和相似相溶原理，该试验选择乙腈、丙酮、正己烷、丙酮+正己烷4种提取溶剂考察提取效果。

通过试验，发现除正己烷外其他3种溶剂提取能力相差不多，都能充分提取出农药残留，但乙腈具有微毒性，并且沸点高，浓缩困难。丙酮虽然渗透性强，但是对于色素、黄酮、酯类等一些物质也有很强的溶解性，在提取过程中也同时提取出大量的杂质，不易凈化。因此，不考虑乙腈和丙酮作为单独提取溶剂[4]。

正己烷虽然对于色素溶解性差，但是不能充分渗透到样品内部，且不能与水相溶，使得提取效率低，27种有机氯回收率在24.3%～58.1%，因此结合丙酮一起使用，既能充分地渗入样品，也能相对较少地提取出其他的杂质，在满足提取效果的前提下，也为后续的净化打下基础。

2.3 提取方式的选择 中药材基质复杂，提取难渗透，选用适宜的提取方法，能让提取溶剂与铁皮石斛基质充分接触、渗透。该试验选用振荡提取、超声波提取和高速均浆提取3种方法考察，发现振荡提取效果较差，超声波提取其次，高速匀浆法提取效果最好（表1）。

样品中加入的提取溶剂的量对于振荡提取影响比较大。通过试验发现，提取溶剂加入量越大，提取的回收率越高，但是随着提取溶剂增加，回收率提升的幅度越来越小。加入少量的溶剂，在振荡提取中不能充分与样品内部接触，从而导致提取不充分，但是大量地增加溶剂会相应地增加成本，并且振荡提取的时间也相对比较长。

超声波提取也是农药残留常见的提取方法，但是在提取过程中，超声波内部水温会随着提取时间增长而升高，而部分农药残留具有热不稳定性及挥发性，因此造成了部分农药残留回收率低下。并且，在整个超声容器中超声波场的分布是不均匀的，类似在波场的分布中有死角，这会使得部分样品的提取效率显著下降，从而导致重现性较差。

使用高速均浆法能在较短时间内，用较少的溶剂得到较好的回收率，并且重现性也较好。高速均浆是样品在高速搅拌下从搅拌缝隙高速喷出，高压高速情况下使得铁皮石斛的粉末进一步被破坏细化，从而使提取溶剂与铁皮石斛粉末充分接触，提高了提取效率，并且提取时间也进一步缩短。

该试验也考察了超声波与振荡联用、超声波与均浆联用、振荡与均质联用，发现超声波与振荡联用回收率有了提高，但是还没有达到试验要求。后面两者回收率与单独使用均浆法相差不多，因此选用高速匀浆法作为该试验的提取方法。

2.4 GPC净化条件的选择 净化是利用农药残留与基体干扰杂质理化性质的差异，将杂质含量减少到能正常检测目标农药的残留水平。GPC可以根据化合物各个分子的大小来实现分离，分子越大通过凝胶色谱柱的速度越快。由于铁皮石斛中含有大量的色素、多糖类大分子物质，单纯地用SPE不能完全除去样品中的杂质，因此可以用GPC来初步净化提取的样品，尽可能多地除去色素、多糖类杂质[5]。

将浓度为0.5 μg/mL的27种农药标准品混标注入GPC，以环己烷+乙酸乙酯（1+1）为流动相，流速为5 mL/min，通过紫外在线图谱（图1），发现这些农药在9.5～17.5 min通过凝胶柱进入检测器。因此选择9.5～17.5 min作为GPC净化收集时间。

2.5 SPE净化柱的选择 通过GPC收集的流出液，发现还是有些颜色，说明有些色素等杂质跟随农药同时被洗脱收集。通过气相色谱的检测，发现杂质干扰目标峰的现象还是比较严重，因此选择固相萃取（SPE）来净化收集液，SPE是目前农药残留应用中最广泛、效果也是比较好的方法[6]。

该试验选择Carb-NH2柱、弗罗里硅土柱、C18柱和氨基柱（表2），发现通过C18柱和氨基柱的净化，样品中还是有很多杂质，使有些目标农残被干扰或者覆盖，可能这两款柱子不能有效地吸附色素，从而不能达到理想的净化效果。而Carb-NH2柱能有效去除样品基质中的有机酸、色素和糖类杂质，弗罗里硅土柱能用于从非水溶液中吸附低极性以及中等极性化合物，有机氯及拟除虫菊酯一般都是非极性或低极性的物质，通过试验发现，Carb-NH2柱和弗罗里硅土柱除杂效果较好，但还是有一些干扰杂质的存在。

通过Carb-NH2柱和弗罗里硅土柱联合使用，净化效果非常理想。先通过Carb-NH2柱除去样品中的色素、糖类及有机酸物质，然后再用弗罗里硅土柱进一步除去一些极性的杂质，并且回收率也达到农药残留的要求，因此选用双柱联用的净化方式。

2.6 前处理方法学考证 样品中加入分成3组的27种有机氯及拟除虫菊酯标准品，进行加标回收、检出限及重复性试验[7]。

3组有机氯及拟除虫菊酯空白样品加标浓度为005 mg/kg的色谱图见图2。

精密称取铁皮石斛样品30份，各个农药加标浓度为0.05 mg/kg和0.50 mg/kg 2个添加水平，重复试验5次，通过GC-μECD检测。试验发现，各个农药的回收率在79.6%～103.1%，重復性在1.98%～8.26%，符合农药残留检测要求（表3）。

3 结论

该试验建立了27种有机氯及拟除虫菊酯在中药饮片铁皮石斛中的GC-μECD的前处理方法：根据实验室的实际条件，用水浸润样品，以丙酮和正己烷作为提取溶剂，高速均浆为提取手段，GPC和弗罗里硅土、Carb-NH2柱固相萃取联用作为净化方式。该方法既可有效提取铁皮石斛中农药残留，又可完全去除杂质干扰，简便、省时、结果准确。所建立的分析方法对各个农药的回收率在79.6%～103.1%，重复性在1.98%～8.26%，符合农药残留检测要求，可推广应用于中药材中农药的残留检测。

参考文献

[1] 傅巧真，路俊仙，王萌.中药材农药残留原因及防治措施的研究进展[J].时珍国医国药，2014（4）：925-927.

[2] 中华人民共和国农业部.蔬菜和水果中有机氯、拟除虫菊酯和氨基甲酸酯类农药多残留的测定：NY/T761-2008[S].北京：中国农业出版社，2008.

[3] 祝贺，宋爱华，田杨，等.GC-MS法同时测定中药材中29种农药残留量[J].沈阳医科大学学报，2007，24（6）：342-347.

[4] CIES"LIK E，SADOWSKA-ROCIEK A，RUIZ J M M，et al.Evaluation of QuEChERS method for the determination of organochlorine pesticide residues in selected groups of fruits[J].Food chemistry，2011，125（2）：773-778.

[5] 吴岩，康庆贺，高凯扬，等.固相萃取-在线凝胶渗透色谱-气相色谱-质谱法测定板栗中44种有机磷农药残留[J].分析化学研究简报，2009，37（5）：753-757.

[6] 楼正云，陈宗懋，罗逢健，等.固相萃取-气相色谱法测定茶叶中残留的 92 种农药[J].色谱，2008，26（5）：568-576.

[7] ZHUANG W E，GONG Z B.Gel permeation chromatography purification and gas chromatography-mass spectrometry detection of multi-pesticide residues in traditional Chinese medicine[J]. American journal of analytical chemistry，2012（3）：24-32.