高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱研究Medaka体内水溶性汞结合蛋白

摘 要 采用高效液相色谱与电感耦合等离子体质谱联用技术，对不同形态汞暴露后的Medaka肝脏和脑组织中水溶性蛋白进行研究，以体积排阻柱为液相分离柱，流动相为0.15 mol/L NH4Ac，流速为0.5 mL/ min。利用电感耦合等离子体质谱对Medaka肝脏和脑组织提取液中铜、锌和汞的含量进行了分析，检出限为0.01～005

SymbolmA@ g/L，元素的加标回收率为93.1%～97.0%。通过与空白组对比发现，汞暴露后的Medaka鱼体肝脏和脑组织对水体中的汞有一定程度的富集；不同形态汞暴露后，在Medaka肝脏和脑组织中的分布明显不同，并且都会在一定程度上降低Medaka肝脏和脑组织中铜与锌的含量，有利于进一步研究汞在生物体内的毒性机理。

关键词 高效液相色谱； 电感耦合等离子体质谱； 汞结合蛋白

1 引 言

汞因其特殊的物理化学性质，一直被广泛应用。但汞具有较高的生物毒性，如神经毒性和肾脏毒性\。自20世纪50年代日本水俣病爆发后，对于汞毒性的研究备受关注，汞污染已经成为一个全球性污染问题\。汞的主要存在形式是单质汞、无机汞和有机汞。不同形态的汞在环境中和生物体中可以相互转化，并且对生物体的毒性也不相同\。环境中的汞污染物被动植物吸收后在生物链中逐渐富集传递进入人体，在被人体肠道吸收后，富集在肝、胃、脑组织等部位，对中枢神经造成危害\，严重的可导致死亡。目前，对于汞的研究主要集中在对环境和生物体中总汞的测定\，以及小分子的有机汞和无机汞的形态分析\，但是汞在生物体内吸收、迁移、转化和代谢的途径以及与生物活性分子结合后对生物活性影响的机理尚不十分清楚。

随着金属组学概念的提出，人们对于金属的研究重点已经从总量测定和小分子的形态分析，转移到金属与生物大分子的相互作用\。在金属结合蛋白的研究中，保证目标蛋白在分离过程中的稳定性十分关键。高效液相色谱与电感耦合等离子体质谱（HPLC-ICP-MS）联用的技术具有接口简单，高效分离，灵敏度高，前处理简单等特点，被广泛应用于生物样品中金属结合蛋白的分析\。 

动物暴露实验是外源性有毒化合物毒理学研究的常用手段。鱼是人类食物摄入汞的主要来源，水体中的汞可通过食物链在鱼体高度富集，富集倍数高达数十万倍\。本研究选用鱼类模型作为研究汞化合物毒性机制的简单有效的实验动物。日本Medaka （Oryzias latipes）自20世纪80年代被国际标准化组织列为毒性实验受试种之一，其具有体形小、饲养方便、繁殖周期短、繁殖能力强、对化学毒物敏感等优点,可很好地应用于多种环境污染物的毒理学实验中，已作为一种国际通用的鱼类模型被广泛使用\。

本实验用不同形态的汞对Medaka进行暴露，利用HPLC-ICP-MS联用技术对甲基汞和无机汞暴露后的Medaka肝脏和脑组织中水溶性汞结合蛋白进行研究，同时还对肝脏和脑组织蛋白提取液中铜、锌和汞的含量进行了测定，有助于进一步研究不同形态汞在生物体中吸收、迁移、累积、生物转化及代谢的机制。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

1200型高效液相色谱仪，7500ce型电感耦合等离子体质谱仪（美国Agilent公司）。

HgCl2（≥99.5，北京化工厂）; 氯化甲基汞（≥98%，德国Merck公司）; HNO3（GR，65%。德国Merck公司）； 甲醇（HPLC纯，美国Baker公司）； 乙酸铵（GR，北京化工厂）; Tris （超纯级，美国Solon公司）。除特别指明外，其它试剂均为分析纯。去离子水（18.3 MΩ cm）来自超纯水系统（Barnstead International, Dubuque, IA, USA）。

取适量HgCl2和氯化甲基汞，分别溶于5%（V/V）HNO3-甲醇混合溶液中，配制成含1000 mg/L Hg的标准储备液，密封于棕色容量瓶中，于4 ℃冰箱中保存。

2.2 动物汞染毒实验

实验用鱼养殖在与实验用水的水质、温度和光照一致的循环流动水系统中，在标准无病害环境下，每天投喂市售丰年虫2次。循环水为自来水经活性炭多层过滤纯化，预先至少曝气24 h以上，其水质参数如下：pH 6.9～7.9；溶解氧浓度为5～7 mg/L；硬度为CaCO3 200 mg/L；电导率为650

SymbolmA@ S/cm；水温保持在22.5～25.5 ℃范围内。白天/黑夜循环时间是12 h/12 h。养殖密度为每升水1 g鱼。实验用鱼均健康并适于常规毒理学暴露实验。

氯化甲基汞和HgCl2染毒实验均为静水暴露方式。选取8月龄Medaka （Oryzias latipes）成鱼，平均体长3.59 cm，平均体重0.52 g，随机分为空白对照组、HgCl2暴露组和氯化甲基汞暴露组，每组20条，暴露组的Hg暴露浓度为20

SymbolmA@ g/L。为了保证合适的水质和稳定的暴露浓度，每日更换暴露溶液。

2.3 样品制备

暴露1周后，解剖取鱼肝脏和脑组织，用0.05 mol/L Tris-HAc缓冲溶液（1∶50，w/w, pH 7.4）匀浆，在4 ℃以12000 r/min离心30 min，取上清液用0.45

SymbolmA@ m的水性滤膜进行过滤，用于实验分析。

2.4 HPLC-UV-ICP-MS分析

蛋白提取液用高效液相色谱进行分离，色谱柱为Nanofilm SEC150体积排阻色谱柱（Sepax Technologies），流动相为0.15 mol/L NH4Ac，流速为0.5 mL/min，进样量20

SymbolmA@ L，紫外检测波长为254 nm。HPLC的流出液用PEEK管直接接入ICP-MS，进行202Hg在线监测。ICP-MS的参数：石英双通道雾室，同心雾化器，RF功率1550 W,载气流速0.85 L/min，辅气流速0.37 L/min，雾室温度2 ℃，测定同位素202Hg。

2.5 提取液中金属总量的测定

配制浓度为1.0，5.0，10.0，20.0和50.0

SymbolmA@ g/L的系列Cu, Zn和Hg混合标准溶液，用ICP-MS测量同位素63Cu，66Zn和202Hg，绘制标准曲线。肝脏和脑组织的蛋白提取液用5% HNO3稀释20倍，用ICP-MS直接测定提取液中Cu, Zn和Hg的含量。以Ge和In为内标，每个样品平行测定3次。

3 结果与讨论

3.1 不同形态汞暴露后Medaka肝脏提取液的HPLC-ICP-MS分析

用HPLC-ICP-MS对Medaka肝脏提取液进行分析，如图1所示。通过与空白组对比可见，经过无机汞和甲基汞暴露后的Medaka肝脏中均有一定量的汞富集。对比HPLC紫外谱图和ICP-MS质谱图的保留时间发现，汞暴露组Medaka肝脏提取液中均含有3个汞结合蛋白/多肽，保留时间分别为4.5，5.4和6.7 min，通过标准蛋白计算其相对应的分子量分别为199，70和14 kDa。在监测Hg的同时，还对Medaka肝脏提取液中的Cu和Zn进行了监测，结果发现，目标蛋白在结合了Hg的同时，还结合了大量Cu2＋和Zn2＋。金属硫蛋白（MT）是一种富含半胱氨酸的金属结合蛋白，分子量为6～7 kDa，有4种异构体MT-Ⅰ，MT-Ⅱ，MT-Ⅲ和MT-Ⅳ，其中MT-Ⅰ和MT-Ⅱ主要分布在肝脏和肾脏中\。根据分子量推测，保留时间为6.7 min的汞结合蛋白可能是金属硫蛋白的聚合物，或者是金属硫蛋白与其它蛋白相互作用后形成的蛋白复合物。但是对于Medaka肝脏提取液中汞结合蛋白的准确结构的确定尚有待深入研究。

对比无机汞暴露组和甲基汞暴露组Medaka肝脏提取液的ICP-MS质谱图还可以发现，不同形态汞暴露后，汞在Medaka肝脏中的分布模式存在一定差异。甲基汞暴露后，Hg主要结合在保留时间6.7 min的蛋白片段上，而无机汞暴露组的汞主要结合在保留时间4.5 min的蛋白片段上。

图1 肝脏提取液的HPLC-ICP-MS谱图

Fig．1 HPLC-ICP-MS spectra of liver extract

A. 空白组（Control group）; B. 甲基汞暴露组（Exposure group of MeHgCl）; C. 无机汞暴露组 （Exposure group of HgCl2）。

3.2 不同形态汞暴露后Medaka脑组织提取液的HPLC-ICP-MS分析

Medaka脑组织提取液的HPLC-ICP-MS分析结果如图2所示。不同形态汞暴露后Medaka脑组织中均富集了一定量的汞，并且含有3个汞结合蛋白/多肽片段，保留时间分别为4.4，5.5和7.1 min，相对应的分子量为209，70和6 kDa。通过对Cu和Zn的监测发现，Medaka脑组织提取液中的汞结合蛋白片段上也含有大量的Cu和Zn。保留时间为6.7 min的汞结合蛋白与金属硫蛋白的分子量大小相符，推断其可能为金属硫蛋白。Aschner等\研究发现，甲基汞会富集星形胶质细胞中，并且诱发星形胶质细胞合成金属硫蛋白。

图2 脑组织提取液的HPLC-ICP-MS谱图

Fig．2 Analysis of brain extraction by HPLC-ICP-MS

A. 空白组 （control group）； B. 甲基汞暴露组 （Exposure group of MeHgCl）; C. 无机汞暴露组 （Exposure group of HgCl2）。

无机汞和甲基汞暴露组中的Medaka脑组织提取液中汞元素的分布存在较大差异。无机汞暴露组Medaka脑组织提取液中汞主要分布在保留时间为4.4 min的蛋白片段上，而甲基汞暴露组中Medaka脑组织提取液中的汞主要分布在保留时间为5.5 min的蛋白片段上。

3.3 不同形态汞暴露后Medaka肝脏和脑组织中Cu, Zn和Hg的总量测定

应用ICP-MS测定Medaka肝脏和脑组织提取液中的Cu, Zn和Hg的干扰主要来源于质谱干扰及生物样品的基体效应。本实验通过优化仪器条件、稀释样品、内标矫正、标准加入等方法消除干扰。同时在总量的测量过程中在线加入1 mg/L Ge和In内标溶液，可以有效克服仪器漂移，保证实验测定的准确性。

Cu, Zn和Hg的标准工作曲线线性相关系数均大于0.9995; 检出限分别为0.02，0.05和0.01

SymbolmA@ g/L。由于缺少Medaka生物组织提取液的标准参考物质，本实验采取加标回收法验证方法的准确性。向空白组Medaka肝脏蛋白提取液中加入1 mg/L的3种金属的混合标准溶液，测定加标回收率。Cu, Zn和Hg的回收率分别为95.2%，93.1%和97.0%。

用ICP-MS对Medaka肝脏和脑组织提取液中的Cu, Zn和Hg含量进行测定，结果如表1所示。与空白组相比，无机汞暴露组和有机汞暴露组Medaka肝脏提取液和脑组织提取液中的常量元素Cu和Zn的含量都有所下降。结合HPLC-ICP-MS的分析结果，肝脏提取液和脑组织提取液中的Hg结合蛋白上也同时含有Cu和Zn，可以推断Hg通过暴露进入鱼体后，与Cu和Zn结合蛋白或者运输蛋白上的活性点位或者非活性点位相结合，取代了活性位点上的Cu和Zn，或者改变了生物大分子的正常代谢功能，从而抑制了鱼体对Cu和Zn的吸收，导致Medaka脑组织和肝脏组织中Cu和Zn的含量下降。

对比甲基汞暴露组和无机汞暴露组可见，甲基汞暴露组Medaka肝脏提取液和脑组织提取液中的Hg的含量明显高于无机汞暴露组，这是因为无机汞在消化道内的吸收率小于10%，而甲基汞的吸收率大于90%\。

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Analysis of Hydrophilic Mercury-Binding Proteins in Medaka （Oryzias

latipes） Using High Performance Liquid Chromatography Coupled

with Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometry

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LI Lu, HE Bin, JIANG Gui-Bin

（Key Laboratory of Environmental Chemistry and Ecotoxicology, Research Center for

Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085）

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Abstract The hydrophilic mercury-binding proteins in the brain and liver extractions of Medaka after methylmercury and inorganic mercury exposure were analyzed by high performance liquid chromato-graphy coupled with inductively coupled plasma mass spectrometry. Size exclusion chromatography was selected in the experiment with a mobile phase of 0.15 mol/L NH4Ac, running at a 0.5 mL/min flow rate. Concentrations of total copper, zinc and mercury in the brain and liver extracts of Medaka were determined by ICP-MS. Detection limits for these three elements were in the range of 0.01

SymbolmA@ g/L to 0.05

SymbolmA@ g/L, and the spike recoveries ranged from 93.1%－97.0%. Compared with the control group, high level of mercury is accumulated in the brain and liver of exposure groups. The distribution patterns of mercury-containing proteins in the brain and liver extracts of Medaka between methylmercury and inorganic mercury exposure group were different. The concentrations of copper and zinc in the brain and liver extractions of both exposure groups were decreased. The studies of the mercury-containing protein fractions in Medaka are helpful for the understanding of the mechanisms of mercury toxicity.

Keywords High performance liquid chromatography; Inductively coupled plasma mass spectrometry; Mercury-containing proteins

（Received 7 December 2010; accepted 4 January 2011）

注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文