精液液化相关基因单核苷酸多态性研究

【摘要】 目的：旨在发现2～3个与精液液化异常相关的前列腺特异性抗原（PSA）基因单核苷酸多态性（SNP）标记，为临床上及早确诊先天性精液液化异常提供一种新的诊断方法，为进一步研究精液液化不良的分子机制和治疗精液液化异常提供理论基础。方法：选择2015年1月1日-5月30日本院生殖中心就诊的100例男性患者，按照精液液化时间分为对照组和研究组各50例，以两组患者外周血DNA为模板，PCR扩增PSA基因的5个外显子后进行测序，通过软件对比分析测序结果，寻找两组PSA基因SNP位点。结果：PSA基因的5个外显子中，外显子2、外显子3有突变，其他外显子无突变；两组外显子2和3检出率比较差异均无统计学意义（P>0.05）；两组等位基因及其频率比较差异均无统计学意义（P>0.05）；对照组的外显子2的基因型有CC、CT、TT，基因型频率分别为0、62.0%、36.0%，研究组的外显子2的基因型有CC、CT、TT，基因型频率分别为0、72.0%、28.0%，两组之间比较差异均无统计学意义（P>0.05）。结论：对照组和研究组精液的液化与PSA基因的这些突变无相关性，可能是PSA基因的这些突变未引起PSA蛋白表达的改变，引起精液液化异常的原因还有待进一步的研究。

【关键词】 前列腺特异性抗原基因； 单核苷酸多态性； 精液液化

Semen Liquefaction Related Gene Single Nucleotide Polymorphisms Research/XIAO Su-mei，GAN Jian-ling，XIA Hua-qiang.//Medical Innovation of China，2016，13（17）：023-025

【Abstract】 Objective：To found that 2-3 PSA gene SNP markers associated with abnormal semen liquefaction，for the future clinical early diagnosis of congenital abnormal semen liquefaction provides a new diagnostic method，in order to further study the molecular mechanism of semen liquefaction which provides the theoretical foundation and treatment of abnormal semen liquefaction.Method：From January 1， 2015 to May 30，100 male patients in our reproductive center were selected，according to the semen liquefaction time were divided into control group and study group，each group had 50 cases，the peripheral blood DNA of the two groups as a template，PCR amplification of PSA gene sequencing，after five exons by sequencing software analysis results，looking for the control group and the team PSA gene single nucleotide polymorphism loci（SNP）.Result：Five PSA gene exon sino-foreign show son 2 mutations and mutation of exon 3，other exons without the mutation，the control group and the team exon 2 and 3 detection comparative differences had no statistical significance（P>0.05）.The control group compared with the study group alleles and frequency difference had no statistical significance（P>0.05）.Exon 2 genotype of the control group had CC， CT， TT， genotype frequency were 0，62.0%，36.0%，respectively，exon 2 genotype of the study group had CC，CT，TT，genotype frequency were 0，72.0%，28.0%，respectively，comparing differences between two groups had no statistical significance（P>0.05）.Conclusion：In the control group and research group of semen liquefaction and PSA genes there is no correlation， these mutations may be PSA genes of these mutations have not been able to cause the change of the PSA protein expression，the causes of abnormal semen liquefied remains to be further research.

【Key words】 The prostate specific antigen gene； Single nucleotide polymorphisms； Semen liquefaction

First-author’s address：Pingxiang Maternal and Child Health Care Hospital，Pingxiang 337055，China doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.17.006

目前，全球范围内不育夫妇约占已婚夫妇的10%～15%，其中男性不育约占50%。精液液化异常是导致男性不育的常见原因之一，流行病学调查占男性不育症病因的2.51%～42.65%[1]。精液凝固与液化的机制研究主要集中在蛋白水解酶系、高分子量的精囊腺蛋白系统、纤溶酶原激活因子系统、微量元素及pH值改变等方面，基因方面包括附睾蛋白酶抑制剂（Eppin）与精囊凝固蛋白I（SgI）、前列腺特异性抗原（prostate-specific antigen，PSA）3个基因。PSA的化学本质为丝氨酸蛋白酶，由前列腺腺管和腺泡上皮细胞合成[2]，其生理功能为降解精液凝胶中主要蛋白（SgⅠ、SgⅡ及纤维连结蛋白），使酪氨酸残基、组氨酸残基和谷氨酸残基水解，精液在5～15 min内液化[3]。编码PSA的基因是人腺体激肽释放酶基因（Human glandular kallikrein gene，HGKG）家族成员之一[4]。PSA基因包括5个外显子和一个由257个氨基酸组成的开放阅读框构成，编码的蛋白约30 kD（即PSA蛋白），其启动子和增强子均具有特色：基因5’端约6 kb长，位于hKl基因上游12 kb，受甾体类激素调控。精液液化异常有先天性的和继发的两种情况，后天性精液液化异常通过一些药物治疗可以有很好的疗效，但先天性精液液化异常通过药物很难治疗，只能通过体外人工机械或加入波罗蛋白酶处理精液，进行辅助生殖技术治疗。如果医务人员对先天性精液液化异常进行药物治疗，既治不好病又耽误患者的最佳治疗时机和增加患者治疗费用[5-7]。因此尽早确定精液液化异常是先天性的还是继发性的就尤为重要。本研究以50位精液液化正常者和50位精液液化异常者外周血DNA为模板，PCR扩增PSA基因的5个外显子后进行测序，通过软件对比分析测序结果，寻找精液液化正常人群和精液液化异常人群PSA基因单核苷酸多态性位点（SNP）。旨在发现2～3个与精液液化异常相关的PSA基因SNP标记，为将来临床上及早确诊先天性精液液化异常提供一种新的诊断方法。为进一步研究精液液化不良的分子机制和治疗精液液化异常提供理论基础。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2015年1月1日-5月30日本院生殖中心就诊的100例男性患者，其中50例精液液化时间异常患者（精液液化时间均大于60 min）为研究组，50例精液液化时间正常男性（精液液化时间均小于30 min）为对照组。所有患者均具有完整的病史资料，对研究知情，自愿参加，并签署知情同意书。研究组年龄25～32岁，平均（27.5±3.5）岁，不育年限1～10年，平均（4.4±0.8）年；

对照组26～33岁，平均（26.5±4.5）岁，不育年限1～10年，平均（4.3±0.9）年。经男科检查所有患者均无输精管、睾丸及附睾的异常，甲状腺功能、性激素四项结果均正常，无染色体异常，无外伤，无家族遗传史和疾病治疗史，排除影响精液质量的其他因素，排除存在前列腺、膀胱等泌尿生殖系统疾病患者。两组患者年龄、病史、不育年限等比较差异均无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 外周血DNA提取 将研究组和对照组患者的外周血分别编号，用亚能生物科技有限公司的DNA提取试剂盒，按操作说明进行DNA提取，保留100 µL DNA溶液。

1.2.2 DNA扩增与测序 将所提取的100份DNA样本送华大基因武汉分公司分别对PSA基因的5个外显子进行测序。测序结果与NCBI中的PSA基因的外显子序列用Blast软件分别进行对比。精液液化正常和异常的PSA基因的外显子序列用Blast软件分别进行对比。

1.3 统计学处理 采用SPSS 16.0统计学软件进行分析，计数资料采用 字2检测，计量资料用（x±s）表示，组间比较使用方差分析t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组等位基因及其频率 所有标本的测序结果与NCBI中的PSA基因的序列用Blast软件进行对比。结果显示，PSA基因的5个外显子中外显子2有突变（由T→C）和外显子3有突变（由C→T），其他外显子无突变。外显子2突变在研究组检出1个，对照组检出1个，两组检出率比较差异无统计学意义（P>0.05）。外显子3有突变在100个标本中检出8个（8.0%），其中研究组检出7个，对照组检出1个，两组外显子突变率比较差异无统计学意义（P>0.05）。对照组等位基因C频率为62.0%，等位基因T频率为38.0%，研究组等位基因C频率为72.0%，等位基因T频率为28.0%，两组比较差异无统计学意义（P>0.05）。

2.2 两组外显子2基因型及其频率 用Blast软件对对照组和研究组PSA基因的外显子2和外显子3序列进行对比。结果显示，对照组的外显子2的基因型有CC、CT、TT，基因型频率分别为0、62.0%、36.0%，研究组的外显子2的基因型有CC、CT、TT，基因型频率分别为0、72.0%、28.0%，两组之间比较差异均无统计学意义（P>0.05）。

3 讨论

在世界上约15%的不孕不育育龄夫妇中，其中由男性因素引起的约占50%。据WHO统计，大约每7对夫妇中就有一对存在着各种生育障碍，而且据报道男性精液的治疗在进几十年来也存在着明显的下降，随之发生的不孕不育率也明显上升[8-12]。其中，精液液化时间长是引起不孕不育的一个重要原因。虽然，精液液化的机制还未被人们完全认识，但目前已发现多种因素参与或影响精液液化[13-15]。前列腺和精囊的分泌物参与了精液的凝固与液化过程，精囊产生的凝固因子引起精液凝固，而前列腺产生的蛋白分解酶、纤溶蛋白酶等精液液化因子使精液液化。正常情况下，两种因子协调作用，精液排出体外很快凝固，一般15～30 min开始液化。液化与凝固因子间的平衡被打破，精液可表现为液化异常[16-18]。在个体发育过程中，由于基因突变或染色体畸形可引起精液液化异常，具体原因可能是各种物理和化学因素作用于DNA分子上，从而改变蛋白质结构的变化，因此改变生物特性[19-20]。

本研究通过以50例精液液化正常者和50例精液液化异常者外周血DNA为模板，PCR扩增PSA基因的五个外显子后进行测序，通过软件对比分析测序结果，寻找精液液化正常人群和精液液化异常人群PSA基因单核苷酸多态性位点（SNP）。结果显示，PSA基因的5个外显子中外显子2有突变（由T→C）和外显子3有突变（由C→T），其他外显子无突变。外显子2突变在研究组检出1个，对照组检出个，两组检出率比较差异无统计学意义（P>0.05）。外显子3有突变在100个标本中检出8个，占8.0%，其中研究组检出7个，对照组检出1个，两组外显子突变率比较差异无统计学意义（P>0.05）。精液液化正常的外显子2的基因型有CC、CT、TT，基因型频率分别为0、62.0%、36.0%，精液液化异常的外显子2的基因型有CC、CT、TT，基因型频率分别为0、72.0%、28.0%，两两之间无明显差异（P>0.05）。精液的液化可能与PSA基因的这些突变无相关性，可能是PSA基因的这些突变未能引起PSA蛋白表达的改变，还有待进一步的研究。外显子3只有8.0%的标本检测到突变，可能标本统计的数量太小所致。

综上所述，在本研究中，PSA基因的5个外显子中外显子2有突变和外显子3有突变，其他外显子无突变。对照组和研究组外显子2的基因型有CC、CT、TT，两者之间比较无明显差异，寻找精液液化异常与基因突变之间的关系需要更多样本及研究的投入，本研究为以后的研究提供了一个方向。

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（收稿日期：2016-02-04） （本文编辑：蔡元元）