西瓜枯萎病病原菌鉴定及药剂联合增效作用

材料与方法

1.1  材料

1.1.1  供试植株  样本来源于海南省陵水县英州镇陵水润达公司设施西瓜（小型西瓜-美月）病株。

1.1.2  供试培养基  马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基和马铃薯葡萄糖（PD）液体培养基。

1.1.3  供试杀菌剂  85%氨基寡糖素原药，海南正业中农高科股份有限公司;97%咪鲜胺原药，湖北晟隆化工有限公司。

1.2  病原菌分离纯化及致病性测定

从患病西瓜植株发病部位的病健交界处切取5 mm×5 mm的组织块，经75%乙醇消毒，在无菌水中漂洗3次后将组织块移到PDA平板中，在25 ℃黑暗条件下培养。待长出菌落后，通过挑取菌落边缘菌丝体进行纯化和转接培养;将纯化的菌种HNXG1601接种到液体培养基（PD）中，28 ℃，125 r/min的恒温摇床上振荡培养6～7 d后，用双层纱布过滤，离心，用血球计数板计算菌悬液浓度，并用无菌水对菌悬液进行稀释，配制成含量为106个孢子/mL的菌悬液，选择伤根法进行接种。设置3次重复，每次10株，接种后的植株置于26～28 ℃玻璃柜中，保湿。待接种植株发病后进行发病调查记录;并对接种发病的植株进行病原菌的再次分离和鉴定[3]。

1.3  病原菌鉴定

挑取纯化好的HNXG1601菌丝在PDA培养基上培养，记录菌落形态，依据分生孢子梗、分生孢子形态特征、大小及其特性鉴定。基因组DNA的提取和纯化采用CTAB法进行，将扩增产物进行测序，并利用Blast与GenBank上已发表基因进行同源性比对。

1.4  毒力测定

采用菌丝生长速率法[3]，根据预试验结果，选择各药剂适当的5个浓度（表1），将配制好的供试药剂母液按照设定的浓度比例加入到已融化并冷却至45 ℃左右的PDA培养基中，充分混匀后分别倒入直径9 cm的灭菌培养皿中，制成系列浓度的含药PDA平板。以不加药剂但含等量无菌水的PDA平板为对照。接入直径5 mm的菌饼，25 ℃恒温培养，每处理设3次重复。采用十字交叉法测量菌落直径，以平均值代表菌落大小。通过浓度对数值（X）和抑制率几率值（Y）之间的线性回归关系求出毒力回归方程和EC50。

2種药剂85%氨基寡糖素和97%咪鲜胺原药进行混配，有效成分配比为1∶1、1∶3、1∶5、3∶1、5∶1，每个配比配制成相应5个浓度梯度。采用生长速率法对西瓜枯萎病菌进行联合毒力测定。计算混配剂对菌丝生长抑菌率，分别求得药剂不同混配比例的毒力回归方程、EC50和相关系数。并根据孙云沛公式计算共毒系数（CTC），确定不同比例混剂的相互作用。

1.5  数据处理

根据各处理7 d的平均菌落直径净增长值，分别计算每种药剂各个浓度的实际抑制率，见式（1）。建立以浓度的自然对数值为自变量（X），抑菌率的几率值为因变量（Y）的回归方程（毒力回归方程见式（2），a为回归截距，b为回归系数），用DPS数据处理系统计算各药剂的EC50[4]。将抑制率换算成几率值（纵坐标）浓度换成10为底对数（横坐标），根据最小二乘法求出EC50。根据孙云沛公式计算共毒系数CTC，见式（3）至式（6）[5]。

抑制率=×100%  （1）

Y=a+bX  （2）

毒力指数（TI）=×100   （3）

实际毒力指数（ATI）=×100 （4）

混配理论毒力指数（TTI）=T1×[A/（A+B）]+T2×[（B/A）+B]   （5）

共毒系数（CTC）=（ATI/TTI）×100   （6）

式中，T1为标准药剂毒力指数;T2为供试药剂毒力指数;A/（A+B）为标准药剂混配中所占的百分比;B/（A+B）为供试药剂混配中所占的百分比。

以CTC评判两种药剂的联合毒力作用。CTC<80为拮抗作用，80≤CTC≤120为相加作用，CTC>120为增效作用。

2  结果与分析

2.1  病害症状及致病性测定

接种5 d后西瓜茎基部开始发病，变黄褐色，有轻微缢缩，并伴有开裂现象，后期叶片萎蔫直至枯死，有时造成幼苗猝倒。症状与田间观察相同，对照没有发病。将发病的病斑进行组织分离，获得的病原菌与原接种菌HNXG1601一致，根据柯赫氏法则证明接种菌即为致病菌。

2.2  病原菌鉴定

培养性状：25 ℃黑暗条件下在PDA培养基上培养4 d，菌丝辐射状向外生长，气生菌丝毡状，绒状，菌落白色至浅红色（图1a）。菌落生长前期培养基为白色，后期培养基不变色或变浅红褐色（图1b）。

显微特征：病原菌菌丝无色，多分枝，具隔膜;产孢细胞为单瓶梗，结构简单，产孢梗短，直立，无色，不具隔膜;典型的小型分生孢子数量多，小型分生孢子假头状着生，卵圆形至椭圆形，大小：6.3～13.8 μm×2.5～4.0 μm;大型分生孢子有或无，镰刀形或梭形，向两端渐尖，足细胞明显，多为2～4个隔膜，大小为18.6～37.8 μm×2.5～4.5 μm（图1c）;厚垣孢子多顶生，单生或串生，黄褐色，球形或近球形。

对病原菌进行扩增，片段大小为545 bp。测序结果与NCBI基因序列进行比对，发现菌株HNXG1601与登录号为KC201696.1的菌株同源性达100%。结合形态学进一步鉴定该病原菌为尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum Schlecht）。

2.3  药剂联合毒力测定

由表2可知，85%氨基寡糖素∶97%咪鲜胺=1∶1、1∶3和1∶5时共毒系数分别为33.68、56.97、73.34，小于80，属于拮抗作用;85%氨基寡糖素∶97%咪鲜胺=3∶1和5∶1时共毒系数分别为167.88和149.67，大于120，具有增效作用，且混配比为3∶1时增效最高，具有明显增效作用。

3  小结与讨论

尖孢镰刀菌是一种严重危害寄主的土壤习居菌，能够侵染葫芦科、茄科、十字花科、豆科、花卉、水果等多种作物，导致枯萎病的发生[6]。枯萎病在作物的全生育期内均可发生[7]，其症状常表现为植株萎蔫、叶片早落、维管束系统褐变、堵塞，最终使植株死亡，造成巨大的经济损失[8]。本研究通过形态学及ITS测序，鉴定出引起海南陵水润达设施西瓜基地西瓜萎蔫死苗的病原菌为尖孢镰刀菌。目前，针对由尖孢镰刀菌引起的枯萎病防控仍以化学药剂防治为主，本研究通过前人对枯萎病的防治研究[9，10]，筛选两类作用机理不同的杀菌剂（免疫诱抗剂和咪唑类杀菌剂）进行混配增效试验，发现85%氨基寡糖素和97%咪鲜胺混配比例为3∶1时，增效作用最好，共毒系数为167.88，对西瓜枯萎病菌菌丝具有很好的抑制效果。

氨基寡糖素本身对病原菌的抑制作用较弱，主要是通过诱导植物体提高自身对外界的免疫力，从而达到抗病效果，促进作物健康生长，是一类新型多功能植物免疫诱抗剂。咪鲜胺是一种高效、广谱、低毒的甾醇脱甲基化抑制剂，其作用方式独特，可通过与细胞色素P450甾醇生物合成的必需酶14α-脱甲基酶（CYP51）的血红素铁相互作用而抑制真菌的生长，目前田间尚未检测到对咪鲜胺产生抗性的尖孢镰刀菌菌株[11]，并且国外早有使用咪鲜胺防治由尖孢镰刀菌引起的枯萎病的报道，并具有较好的防治效果[12]，但在中国尚未大面积应用推广。

本试验室内药剂毒力测定结果表明，85%氨基寡糖素∶97%咪鲜胺=3∶1对西瓜枯萎病菌菌丝具有很好的抑制效果，为西瓜生产上防治枯萎病提供了理论依据。

参考文献：

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[2] 王晓玮.设施栽培中蔬菜根结线虫鉴定及蔬菜种质资源抗病性[D].杭州：浙江大学，2013.

[3] 方中达.植病研究方法[M].北京：中国农业出版社，1998.46-47.

[4] 慕立义.植物化学保护研究方法[M].北京：中国农业出版社，1991.124-125.

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[8] 裴月令，曾凡云，彭  军，等.尖孢镰刀菌与寄主互作机理研究进展[J].热带生物学报，2014，5（1）：92-100.

[9] 徐作珽，李  林，李长松，等.中生菌素和氨基寡糖素对西瓜枯萎病防治试验[J].中国蔬菜，2003（3）：10-12.

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[11] 裴龙飞，朱发娣，柴阿丽，等.中国华北地区瓜类尖孢镰刀菌对咪鲜胺的敏感性及抗药突变株生物学性状研究[J].农药学学报，2016，18（5）：575-581.

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