陆地棉脂肪酸去饱和酶基因GhFAD2-1的克隆与表达分析

材料，克隆其种子脂肪酸去饱和酶基因GhFAD2-1，并对该基因编码蛋白进行序列分析;利用qRT-PCR检测GhFAD2-1在种子发育过程中的表达情况;同时用气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）分析种子发育过程中的脂肪酸组分，以期为进一步研究GhFAD2-1基因的调控机制、改良棉籽油的品质奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料、菌株、质粒及主要试剂

陆地棉（Gossypium hirsutum）品种新陆早33号、大肠杆菌菌株Escherichia coli XL1-Blue均由笔者所在实验室保存。Ex Taq DNA聚合酶、限制性内切酶、DNA Marker等购自宝生物工程（大连）有限公司。普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（DP209）、植物总RNA提取试剂盒（DP437，离心柱型）等购自天根生化科技（北京）有限公司。第1链反转录试剂盒（PrimeScriptTM 1st strand cDNA Synthesis Kit）、克隆载体 pGEM-T easy vector和SYBR Premix Ex TaqTM（Perfect Real Time）等购自宝日医生物技术（北京）有限公司（TaKaRa）。

1.2 GhFAD2-1基因的克隆

取新陆早33号花后35 d的棉花种子，去除外层软壳后，将棉仁在研钵中用液氮冷激后快速研磨，将粉末快速装入RNase-free的离心管中，保证样品不溶解，并让液氮挥发，采用植物總RNA提取试剂盒（DP437，离心柱型）提取总RNA，利用PrimeScriptTM 1st strand cDNA Synthesis Kit将1 μg总RNA反转录成cDNA。利用已知的FAD2-1基因序列信息（GenBank：HQ259410.1），设计特异性引物，上游：5′-ATGGGTGCCGGTGGTAGGA-3′，下游：5′-TTAGAACTTGTTACGATACC-3′。特异性引物由北京六合华大基因科技有限公司合成。以反转录总RNA获得的cDNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应条件为：94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35个循环;72 ℃ 10 min。目标条带回收步骤按照普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（DP209）的说明书进行。利用克隆载体连接试剂盒将回收片段连接到pGEM-T easy vector上，获得pGEM-T-FAD2-1。转化E.coli XL1-Blue，筛选抗氨苄青霉素的菌落，并进行菌落PCR鉴定和测序。

1.3 序列分析、比对与进化树的构建

使用DNAMAN软件将克隆获得的棉花FAD2-1氨基酸序列与其他主要油料作物的FAD2-1氨基酸序列（分别来源于GenBank、EMBL、PDB等）进行多序列比对。利用MEGA 5.0软件，采用邻接法（1 000次重复）聚类分析构建系统进化树。

1.4 不同发育时期棉籽GhFAD2-1的qRT-PCR分析

分别采集开花后5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60 d 的棉铃，在室内用无菌的镊子剥去棉籽壳。采用植物总RNA提取试剂盒（DP437，离心柱型）提取总RNA，使用第1链反转录试剂盒将1 μg总RNA反转录成cDNA。利用 qRT-PCR方法对GhFAD2-1基因在不同发育时期棉籽中的表达水平进行差异分析。qRT-PCR在实时荧光定量PCR仪LightCycler480（Roche）上进行，内参基因为UBI，引物为RTGhFAD2-1F：5′-TGGCGTTAAACTGCTTTCT-3′和RTGhFAD2-1R：5′-CGGAATGGCTTGCTTGAT-3′，反应体系为10 μL：SYBR Primix Ex TaqTM（2×） 5 μL，10 μmol/L 引物各0.5 μL，ddH2O 3 μL，cDNA模板1 μL。每个样品设3次重复，试验结果采用2-ΔΔCT法[16]分析。

1.5 棉籽脂肪酸组分的GC-MS分析

采用索氏提取法（石油醚法）[17-18]提取棉籽中的总油脂。将种子在80 ℃条件下烘干至恒质量，研磨后取1 g样粉包入定量滤纸中，放入萃取瓶套筒内，加130 mL石油醚（沸点为30～60 ℃）浸泡8 h;使用Gerhardt（德国格哈特）索氏全自动抽提仪提取棉籽总油脂。采用KOH-甲醇法对所提取的油脂进行甲酯化：向提取的油脂中加入5 mL正己烷，摇晃均匀后向混合溶液中加入5 mL 0.4 mol/L KOH-甲醇溶液，然后将溶液转移至玻璃瓶中，在37 ℃恒温摇床上振荡 30 min，静置 20 min 后取上清，备用。

使用GC-MSQP2020气相色谱-质谱联用仪（岛津公司）分析棉籽油脂肪酸组分。色谱柱为HP-88弹性石英毛细管柱（长度：100 m，膜厚：0.20 μm，内径：0.25 mm），采用程序升温法升温：40 ℃（2 min）→4 ℃/min→240 ℃（15 min），柱箱温度为40 ℃;进样口温度为250 ℃;分流比为10 ∶ 1;载气为He;吹扫流量为3 mL/min。质谱的离子源为电子轰击电离（EI）源，离子源温度为200 ℃，接口温度为250 ℃，溶剂延迟13 min。

2 结果与分析

2.1 GhFAD2-1基因的克隆

应用植物总RNA提取试剂盒（DP437，离心柱型）提取获得高质量的棉籽总RNA（图1）;采用第1链反转录试剂盒（TaKaRa）将总RNA反转录成cDNA。对新陆早33号的cDNA进行扩增时，在1 100 bp左右出现目标条带（图2）。取3个阳性克隆进行测序，结果（图3）表明，该cDNA全长为 1 158 bp，为一个完整的基因编码区。

2.2 GhFAD2-1基因编码蛋白氨基酸序列比较与分析

对获得的GhFAD2-1基因序列进行分析，结果表明，基因编码区全长1 158 bp，共编码385个氨基酸（图3）。利用在线分析平台 ExPASy（http：//web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam）分析该基因编码蛋白的基本理化性质，结果表明，GhFAD2-1编码的蛋白分子式为C3 555H5 954N1 158O1 499S295，分子量为98.360 94 ku。预测蛋白的等电点是 5.01，脂肪指数为22.80，蛋白疏水性预测平均值为0.752，属于疏水性蛋白。使用SOPMA软件对GhFAD2-1的二级结构进行分析预测，结果表明，该蛋白主要由α-螺旋、β-片层、β- 转角及无规则卷曲等组成，其中α-螺旋包含160个氨基酸，占41.56%;β-片层包含83个氨基酸，占21.56%;β-转角包含36个氨基酸，占9.35%;无规则卷曲包含106个氨基酸，约占27.53%，说明α-螺旋是二级结构中的主要组成部分。

进一步利用EMBL-EBI（https：//www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search）在线分析工具，结合NCBI中BlastP比对，对该基因编码的氨基酸序列进行蛋白保守结构域分析，结果（图4）发现，GhFAD2-1蛋白具有1个典型

的FAD2结构域（在生物体的细胞内维持细胞膜的结构和功能）和1个FAD2-N端结构（具有氧化还原酶活性，作用于成对的供体，氧化成对的供体，导致1分子氧还原为2分子水），表明GhFAD2-1基因属于典型的FAD2基因家族成员。

为了解棉花GhFAD2-1与其他油料作物FAD2-1蛋白的亲缘关系，利用ClustalX软件和MEGA 6.0软件对 GhFAD2-1 氨基酸序列与NCBI上公布的主要油料植物FAD2-1蛋白进行多重比较。结果（图5）表明， 本研究从新

陆早33号中克隆的陆地棉GhFAD2-1编码蛋白与花生、油菜、油茶、大豆、油葵、橄榄、芝麻等油料作物FAD2-1蛋白的一致性分别为75%、60%、75%、76%、64%、78%、77%，且一致性主要集中在FAD2结构域部分。

基于棉花GhFAD2-1与其他油料植物FAD2-1基因编码蛋白序列构建进化树，采用邻接法（neighbour joining）进行聚类分析，结果（图6）表明，棉花GhFAD2-1与花生 AhFAD2-1、大豆GmFAD2-1基因属于同一个进化分支，与油葵、芝麻等作物的FAD2-1基因遺传距离相对较远，同源性相对较低。

2.3 GhFAD2-1表达水平与油酸含量/亚油酸含量的相关性

为了解GhFAD2-1表达水平与油酸/亚油酸含量比的相关性，本研究分别取开花后5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60 d共12个不同发育时期的棉籽样品进行分析。由于发育早期棉籽体积快速增加，但水分含量高，因此棉籽发育早期取样量较大。为减少试验误差，所取棉铃统一位于第3果枝。采用GC-MS对棉籽发育过程中的各脂肪酸组分进行分析，结果（表1）表明，棉籽中最主要脂肪酸成分为单不饱和脂肪酸油酸和多不饱和脂肪酸亚油酸。

为了解GhFAD2-1在棉籽发育过程中的时空表达特性，利用qRT-PCR技术对GhFAD2-1基因在不同发育时期棉籽中的表达水平进行分析。结果（图7）表明，GhFAD2-1在棉籽发育早期表达量较低;随着棉籽的发育，GhFAD2-1表达量逐渐升高，在开花后40 d表达量达到峰值，随着棉籽成熟度的继续增加表达量下降，表明GhFAD2-1基因可能在棉籽发育过程中发挥着重要的作用。

在本试验中，C18 ∶ 1、C18 ∶ 2含量总计占脂肪酸总量的37.69%～75.68%，对棉籽发育过程中C18 ∶ 1含量/C18 ∶ 2含量的值进行分析，结果（图7）表明，在棉籽发育早期该比值随着棉籽的发育逐渐减小，到开花后40 d减小至最低值，为0.17。之后，C18 ∶ 1含量/C18 ∶ 2含量的值略有上升但总体变幅较小。棉籽发育初期GhFAD2-1基因表达量在逐渐升高的同时，C18 ∶ 1含量/C18 ∶ 2含量的值减小，至开花后 40 d 时，GhFAD2-1基因表达量达到峰值的同时，C18 ∶ 1含量/C18 ∶ 2含量的值减小到最小值;棉籽发育后期，GhFAD2-1基因表达量降低而C18 ∶ 1含量/C18 ∶ 2含量的值则呈现上升趋势。总体来说，在棉籽发育过程中C18 ∶ 1含量/C18 ∶ 2含量的值与GhFAD2-1基因的表达量呈负相关关系。

3 讨论

FAD2是位于植物细胞内质网与质体膜上的膜蛋白[19]，其功能是催化含有1个不饱和键的脂肪酸油酸（C18 ∶ 1）碳链脱氢，在其第12位碳原子上引入1个双键，从而形成含有2个双键的多不饱和脂肪酸亚油酸（C18 ∶ 2）[20]。FAD2基因是控制油酸向亚油酸转化的关键酶基因，其表达水平对细胞中多不饱和脂肪酸的含量与比例起着重要的调控作用[21]。

FAD2-1是在种子中特异高效表达的FAD2基因，对调控植物油中脂肪酸组分有重要作用[22]。本研究从新陆早33号中克隆了GhFAD2-1基因，对该基因编码的氨基酸序列进行蛋白保守结构域分析，结果发现，GhFAD2-1基因具有1个典型的FAD2结构域和1个FAD2-N端结构，GhFAD2-1基因属于典型的FAD2基因家族成员，多序列比对发现，不同油料植物FAD2-1同源性主要集中在FAD2结构域，而 FAD2-N 端结构差异较大。

脂肪酸组分的组成及相对比例是决定食用油品质的重要因素。棉籽脂肪酸的种类、总量、相对比例在不同品种之间是不同的[23]。C18 ∶ 1和C18 ∶ 2是组成棉籽脂肪酸的最主要成分，棉籽油的品质在很大程度上取决于C18 ∶ 1、C18 ∶ 2的含量以及C18 ∶ 1含量/C18 ∶ 2含量的值。本研究气相色谱- 质谱分析结果表明，陆地棉新陆早33号棉籽脂肪酸不同组分的含量在棉籽发育过程中并非恒定不变，而是随着棉籽发育呈现动态变化。结合qRT-PCR分析结果来看，C18 ∶ 1 含量/C18 ∶ 2 含量的值总体上与GhFAD2-1基因表达量呈高度负相关关系。GhFAD2-1在棉籽发育早期表达量逐渐增加，编码的FAD2-1促进C18 ∶ 1向C18 ∶ 2转化，C18 ∶ 2 在总脂肪酸中的相对含量呈增長趋势，而同时 C18 ∶ 1 含量相应减少，即C18 ∶ 1含量/C18 ∶ 2含量的值逐渐减小。而在棉籽发育的后期，GhFAD2-1基因表达量降低，C18 ∶ 1含量/C18 ∶ 2 含量的值稍有增加，但随着棉籽的逐渐成熟，棉籽中C18 ∶ 1和C18 ∶ 2的积累量减少，C18 ∶ 1含量/C18 ∶ 2含量的值趋于平稳。综上所述，GhFAD2-1基因在棉籽发育过程中对C18 ∶ 1含量和C18 ∶ 2合成发挥着重要的调控作用。本研究克隆获得棉花的GhFAD2-1基因，并对其在不同发育时期棉籽中的表达水平与C18 ∶ 1含量/C18 ∶ 2 含量的相关性进行分析，可为进一步在分子水平上研究GhFAD2-1的表达与调控机制以及棉籽油的品质改良奠定基础。

参考文献：

[1]宋俊乔，孙培均，张 霞，等. 棉仁高油分材料筛选及其脂肪酸发育分析[J]. 棉花学报，2010，22（4）：291-296.

[2]Vos E，Cunnane S C. Alpha-linolenic acid，linoleic acid，coronary artery disease，and overall mortality[J]. American Journal of Clinical Nutrition，2003，77（2）：521-522.

[3]McConn M，Browse J. Polyunsaturated membranes are required for photosynthetic competence in a mutant of Arabidopsis[J]. The Plant Journal，1998，15（4）：521-530.

[4]Pham A T，Shannon J G，Bilyeu K D. Combinations of mutant FAD2 and FAD3 genes to produce high oleic acid and low linolenic acid soybean oil[J]. Theoretical and Applied Genetics，2012，125（3）：503-515.

[5]Heppard E P，Kinney A J，Stecca K L，et al. Developmental and growth temperature regulation of two different microsomal omega-6 desaturase genes in soybeans[J]. Plant Physiology，1996，110（1）：311-319.

[6]Buhr T，Sato S，Ebrahim F，et al. Ribozyme termination of RNA transcripts down-regulate seed fatty acid genes in transgenic soybean[J]. Plant Journal，2002，30（2）：155-163.

[7]Kinney A J. Genetic modification of the storage lipids of plants[J]. Current Opinion in Biotechnology，1994，5（2）：144-151.

[8]Peng Q，Hu Y，Wei R，et al. Simultaneous silencing of FAD2 and FAE1 genes affects both oleic acid and erucic acid contents in Brassica napus seeds[J]. Plant Cell Reports，2010，29（4）：317-325.

[9]Shanklin J，Cahoon E B. Desaturation and related modifications of fatty acids[J]. Annual Review of Plant Biology，1998，49：611-641.

[10]Li L Y，Wang X L，Gai J Y，et al. Isolation and characterization of a seed-specific isoform of microsomal omega-6 fatty acid desaturase gene （FAD2-1B） from soybean[J]. DNA Sequence，2008，19（1）：28-36.

[11]Liu Q，Singh S P，Brubaker C L，et al. Molecular cloning and expression of a cDNA encoding a microsomal ω-6 fatty acid desaturase in cotton（Gossypium hirsutum）[J]. Australian Journal of Plant Physiology，1999，26（2）：101-106.

[12]Pirtle I L，Kongcharoensuntorn W，Nampaisansuk M，et al. Molecular cloning and functional expression of the gene for a cotton Δ-12 fatty acid desaturase （FAD-2）[J]. Biochimica et Biophysica Acta，2001，1522（2）：122-129.

[13]Mikkilineni V，Rocheford T R. Sequence variation and genomic organization of fatty acid desaturase-2 （fad2） and fatty acid desaturase-6 （fad6） cDNAs in maize[J]. Theoretical and Applied Genetics，2003，106（7）：1326-1332.

[14]Chi X Y，Yang Q L，Pan L J，et al. Isolation and characterization of fatty acid desaturase genes from peanut（Arachis hypogaea L.）[J]. Plant Cell Reports，2011，30（8）：1393-1404.

[15]Scheffler J A，Sharpe A G，Schmidt H，et al. Desaturase multigene families of Brassica napus arose through genome duplication[J]. Theoretical and Applied Genetics，1997，94（5）：583-591.

[16]Livak K J，Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method[J]. Methods，2001，25（4）：402-408.

[17]姚 虹. 索氏提取法測定脂肪含量方法改进[J]. 中州大学学报，1996（4）：64-65.

[18]王小艺，曹一博，张凌云，等. 油茶生长发育过程中脂肪酸成分的测定分析[J]. 中国农学通报，2012，28（13）：76-80.

[19]Alonso D L，García-Maroto F，Rodríguez-Ruiz J，et al. Evolution of the membrane-bound fatty acid desaturases[J]. Biochemical Systematics and Ecology，2003，31（10）：1111-1124.

[20]Liu Q，Brubaker C L，Green A G，et al. Evolution of the FAD2-1 fatty acid desaturase 5′UTR intron and the molecular systematics of Gossypium（Malvaceae）[J]. American Journal of Botany，2001，88（1）：92-102.

[21]Qin Y M，Hu C Y，Pang Y，et al. Saturated very-long-chain fatty acids promote cotton fiber and Arabidopsis cell elongation by activating ethylene biosynthesis[J]. Plant Cell，2007，19（11）：3692-3704.

[22]赵立群，李 仁，李 蔚，等. 棉花FAD2-1基因的克隆及其ihpRNA和amiRNA干扰载体的构建[J]. 棉花学报，2011，23（2）：189-192.

[23]王美霞，周大云，马 磊，等. 棉籽油脂肪酸组成分析与评价[J]. 食品科学，2016，37（22）：136-141.和文志，潘鹏举，杨 玲，等. 基于ISSR标记的铁线莲园艺品种遗传多样性分析和指纹图谱构建[J]. 江苏农业科学，2019，47（12）：79-82.

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2019.12.016