鸡血藤ISSR反应体系的建立与优化

摘要：为建立鸡血藤ISSR-PCR的优化反应体系，通过选用DNA模板量、Mg2+、Taq DNA聚合酶、dNTP、引物浓度等5个因素中各单因素的适宜浓度，利用正交试验方法，在5个因素4个水平条件下进行优化。结果发现，鸡血藤ISSR-PCR的最佳25 μL PCR反应体系中含10×PCR buffer 2.50 μL、DNA模板量70.00 ng、Mg2+ 1.50 mol/L、Taq DNA聚合酶1.50 U、dNTP 0.30 mmol/L，引物浓度0.35 μmol/L。为鸡血藤种质资源遗传多样性的进一步研究奠定分子基础，也为同科属植物的种质资源遗传多样性研究提供参考。

關键词：鸡血藤；ISSR 反应体系；单因素试验；正交试验

中图分类号： S567.901文献标志码： A文章编号：1002-1302（2017）17-0054-03

作者简介：周敏（1991—），女，江西赣州人，硕士研究生，研究方向为中药品种鉴定与质量评价。E-mail：zmlww1020@163.com。

通信作者：田慧，硕士，教授，研究方向为中药品种鉴定与质量评价。E-mail：377244732@qq.com。《中国药典》2015版规定鸡血藤来源于豆科植物密花豆（Spatholobus suberectus Dunn.）的干燥藤茎[1]。鸡血藤为我国常用中药，具有补血活血、调经止痛、舒筋活络的功效，用于治疗月经不调、痛经、经闭、风湿痹痛、麻木瘫痪、血虚萎黄等。鸡血藤主要分布于广西壮族自治区、广东省、云南省、越南等地，由于近年来鸡血藤生境遭受了严重破坏及用药需求不断增长，其野生资源日益减少，价格也不断攀升。鸡血藤的引种栽培受到了高度重视，目前在广西壮族自治区、广东省等地已建成一些鸡血藤野生抚育或规范化生产示范基地，但不同产地及人工栽培造成药材质量良莠不齐，因此选择栽培地鸡血藤显得十分必要。虽然近年来国内学者对鸡血藤的性状、显微、理化等方面进行了较多的研究，在鸡血藤种质资源方面也有少数学者进行了分子方面的研究[2-4]。如翟明等从110条RAPD引物中筛选出9条RAPD随机引物，对不同产地的鸡血藤进行了研究[5]；安冉等利用26S DNA D1-D3区序列差异鉴别鸡血藤及其混伪品[6]；笔者所在课题组田辉等采用RAPD与ISSR标记的方法初步对广西省产鸡血藤进行了遗传多样性的比较分析研究[7]。但目前尚未见有建立稳定的ISSR反应体系的报道，故本试验对鸡血藤ISSR反应体系进行建立与优化，运用单因素试验和正交试验建立一套准确性高、稳定性强且适用于大批量鸡血藤种质材料微卫星标记的ISSR-PCR反应体系，不仅为鸡血藤种质资源遗传多样的进一步研究奠定了分子基础，也为同科属植物的种质资源遗传多样性研究提供了参考。

1材料与方法

1.1供试材料

试验材料为鸡血藤嫩叶，采自广西药用植物园栽培基地，由广西中医药大学田慧教授鉴定为豆科植物密花豆（Spatholobus suberectus Dunn.）。

1.2主要试剂与仪器

1.2.1试剂DNA提取试剂盒、Taq DNA聚合酶、dNTP、DNA marker、5×TBE购自天根生化科技（北京）有限公司，琼脂糖（西班牙），GelRed核酸凝胶染料（美国），其他试剂均为国产分析纯，ISSR引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.2仪器Eppendorf移液枪（德国）、SIGMA Sartorius台式冷冻离心机（德国）、T-Gradient型梯度PCR仪（德国）、Bio-rad电泳仪（美国）、ChemiDoc XRS凝胶成像系统（美国）、MILIPORE超纯水机（法国）、涡旋振荡仪器（上海青浦滬西仪器厂）、微量分光光度计（日本岛津）。

1.3试验方法

1.3.1鸡血藤DNA的提取根据天根生化科技（北京）有限公司植物基因组DNA提取试剂盒的操作步骤进行试验材料总DNA的提取，同时采用微量分光光度法定量检测其质量及浓度，并稀释至10 ng/μL以供后续试验。

1.3.2单因素试验根据相关文献[8-9]，本试验ISSR基本反应体系的组成为总体积25 μL，其中DNA模板30.00 ng、Mg2+ 1.50 mmol/L、dNTP 0.15 mmol/L、Taq DNA聚合酶 1.50 U，引物浓度0.30 μmol/L，10×反应buffer 2.5 μL，其余用灭菌超纯水补齐。扩增程序为95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，36 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30个循环；最后 72 ℃ 延伸5 min。待反应结束后，将产物置于4 ℃冰箱中保存。根据笔者所在课题组前期试验结果，选用43号引物（引物序列为5′-3′GATGATGATGATTC）。反应选用DNA模板、Mg2+、dNTP、Taq DNA聚合酶、引物为考察因素，反应体系中单因素梯度设计见表1，即在单一因素变化的条件下，保持其他因素不变，从而筛选出比较适宜的浓度范围。取扩增产物8 μL，点样于1.0%琼脂糖凝胶的上样孔中，以1 500 bp DNA ladder marker为对照分子质量标准，在0.5×TBE缓冲液中电压 75 V 电泳45 min，在凝胶成像系统中观察、拍照、记录、分析检测结果。

宜范围为参考依据，选用L16（45）正交表，在4个水平上进行试验（表2）。

2结果与分析

2.1DNA模板添加量对ISSR-PCR反应的影响

试验结果见图1，添加DNA模板20 ng时，扩增出来的条带暗且少，说明添加量低对ISSR-PCR扩增影响较大。随着添加量的增加，扩增条带增多，因此正交试验中选用的模板添加量为40、50、60、70 ng。

2.2Mg2+浓度

试验结果见图2，当Mg2+浓度为0.5 mmol/L时，扩增的条带最少，且不清晰，当浓度为1.0 mmol/L时，条带逐渐增多，当浓度为3.0 mmol/L时，扩增条带减少。由于Mg2+是Taq DNA聚合酶的辅助因子，其浓度影响Taq DNA聚合酶的活性，又兼在保证特异性条带和清晰度的情况下，故确定

ISSR体系中Mg2+适宜浓度为1.0～2.0 mmol/L。

2.3dNTP浓度

试验结果见图2，当dNTP浓度为0.05～0.10 mmol/L时，PCR的产率较低，扩增出来的条带模糊。随着浓度的升高，非特异性条带增多，碱基的错配率增加。故正交试验中dNTP适宜浓度为0.15～0.30 mmol/L。

2.4Taq DNA聚合酶添加量

试验结果见图3，随着Taq DNA聚合酶添加量的增加，特异性条带增加，亮度也增加。Taq DNA聚合酶是PCR反应中重要的影响因素，量太少不能扩增出特性条带，Taq DNA聚合酶价格高，量太多增加成本。故正交试验中选用Taq DNA聚合酶添加量为1～2 U。

2.5引物浓度

试验结果见图3，引物浓度对PCR产生的影响很大，浓度过低时PCR产物会大大降低，影响正常的扩增；浓度过大时，PCR扩增的条带变得模糊，非特异性增加。故正交试验中选用引物浓度为0.2～0.4 μmol/L。

2.6正交试验

试验结果见图4，条带稳定、清晰、丰富的最佳产物记为16分，最差的记1分。编号1～16打分结果依次为1、2、4、6、5、3、7、8、16、14、15、13、10、12、11、9。根据打分结果算出每个因素同水平下的均值和极差（表3）。极差值反映出影响因子对反应体系的影响，而且极差值越大，影响越明显。由表3可知，各因素对鸡血藤ISSR-PCR反应影响大小的先后次序为TaqDNA聚合酶添加量>Mg2+浓度>引物浓度>DNA模板添加量>dNTP浓度。每个因素同水平下的均值反映出影响因子各水平对反应体系的影响情况，均值越大，反应水平越好[10]。因此，鸡血藤最优反应体系为TaqDNA聚合酶 1.50 U，DNA模板为 70 ng，Mg2+为1.5 mmol/L，dNTP为030 mmol/L，引物 0.35 μmol/L。

4结论与讨论

ISSR分子标记技术在亲缘关系、品种鉴定及遗传多样性检测等方面得到了广泛应用[11-13]。ISSR分子标记技术容易受外界环境因素的影响，如PCR体系的配置、引物、退火温度等。目前常用单因素试验和正交试验对ISSR试验进行优化，单因素试验可选定单个因素最佳试验条件的范围，如张福生等运用单因素试验建立与优化了金线莲的ISSR反应体系[14]。正交试验可平衡分析各个因素对试验的综合影响，可更加准确地得到最佳优化条件，如曹嵩晓利用单因子和正交设计双重试验方法优化了广藿香ISSR-PCR试验体系，从而得到最佳反应体系[15]。本研究综合运用单因素和正交试验2种方法，克服单一试验方法的局限性。

本研究结果表明，ISSR反应体系中，Taq DNA聚合酶添加量对结果的影响极大，Taq DNA聚合酶在水中不易溶解完全，稀释时须溶解在2×反应buffer中。筛选合适的引物，有利于结果的判断，合适的退火温度可使目的条带最大程度地扩增，也可使目的条带更亮。因此，本试验选出鸡血藤的最佳反应体系为TaqDNA聚合酶1.50 U，DNA模板70 ng，Mg2+ 1.5 mmol/L，dNTP 0.30 mmol/L，引物0.35 μmol/L，最佳退火温度36 ℃。本试验确定了鸡血藤的最佳ISSR-PCR反应体系，也为同科属植物的种质资源遗传多样性研究提供了参考，为后续鸡血藤种质多态性研究提供了科学依据。

参考文献：

[1]国家药典委员会. 中华人民共和国药典：一部[M]. 北京：化学工业出版社，2015.

[2]李玉梅，金晓玲. 鸡血藤及其混淆品大血藤、白花油麻藤的鉴别[J]. 时珍国医国药，2003，14（1）：33.

[3]傅桂全. 鸡血藤与混淆品大血藤、过岗龙的鉴别[J]. 海峡药学，2008，20（6）：96-98.

[4]严启新，李萍. 鸡血藤及其混淆品的紅外光谱比较研究[J]. 中药材，2002，25（11）：788-790.

[5]翟明，刘军民，安冉，等. 鸡血藤类药材种质资源的RAPD分析[J]. 中药新药与临床药理，2010，21（4）：413-415.

[6]安冉，杨锦芬，刘军民，等. 基于26S rDNA D1-D3区序列分析的鸡血藤及其混淆品的分子鉴别[J]. 广州中医药大学学报，2010，27（4）：403-406.

[7]田辉，蒋嫦月，朱华，等. 广西产鸡血藤遗传多样性的RAPD与ISSR标记方法的比较研究[J]. 中国药房，2015，26（31）：4348-4350.

[8]廖丽，郭巧生. 夏枯草ISSR分子标记技术的建立与体系优化[J]. 中草药，2009（7）：1131-1135.

[9]欧立军，颜旺，廖亚西，等. 天门冬ISSR分子标记技术的建立与体系优化[J]. 中草药，2011，42（2）：353-357.

[10]李鹏，汪阳东，陈益存，等. 油桐ISSR-PCR最佳反应体系的建立[J]. 林业科学研究，2008（2）：194-199.

[11]赵谦，杜虹，庄东红. ISSR分子标记及其在植物研究中的应用[J]. 分子植物育种，2007，5（F11）：123-129.

[12]孙洪，程静，詹克慧，等. ISSR标记技术及其在作物遗传育种中的应用[J]. 分子植物育种，2005，3（1）：123-127.

[13]罗海燕，陈业渊. ISSR分子标记及其应用[J]. 安徽农学通报，2008，14（19）：45-46.

[14]张福生，郭顺星. 金线莲ISSR反应体系的建立与优化[J]. 中草药，2011，42（1）：137-142.

[15]曹嵩晓，李娟玲，刘国民，等. 利用单因子和正交设计双重实验方法优化广藿香ISSR-PCR实验体系[J]. 热带生物学报，2011，2（1）：35-41.任海，付立东，王宇，等. 硅磷肥对水稻生长发育及产量品质的影响[J]. 江苏农业科学，2017，45（17）：57-61.