中药复方多糖对鸡淋巴细胞免疫信号分子表达的影响

材料与方法

[HTK]1.1试验药物[HT]

中药复方多糖是由笔者所在实验室自主开发的中药复方免疫增强剂，经水提-醇沉法提取后，由AB-8大孔吸附树脂吸附解吸附后获得精制中药多糖，经苯酚-硫酸法测定中药多糖含量为79.6%。采用灭菌蒸馏水将其配制成 200 μg/mL 的中药复方多糖母液，经0.22 μm微孔滤膜过滤后，于4 ℃下储存备用。

1.2试剂与仪器

葡萄糖标准品、苯酚、氢氧化钠、碳酸氢钠、乙醇、丙酮、石油醚、浓硫酸均为AR级。鸡外周血淋巴细胞分离液（TBD，天津市灏洋生物制品科技有限责任公司），PBS磷酸缓冲液（Hy Clone，赛默飞世而生物化学制品北京有限公司），胎牛血清（Gibco公司），RPMI1640培养基（Hy Clone），双抗（Gibco公司）。鸡cAMP、cGMP、Ca2+、NO、iNOSELISA检测试剂盒均购自上海蓝基生物科技有限公司。

生物安全柜（Thermo公司），CO2培养箱（Thermo公司），垂直离心机（Thermo公司），OLYMPUS倒置相差显微镜，Power Wave XS2 BioTek型酶标仪。

1.3试验动物

40羽新疆黄麻鸡购自石河子市孵化场，按照试验动物饲养方法饲养至体质量达1.5～2.0 kg。

1.4试验方法

1.4.1鸡外周血淋巴细胞的分离与培养

采用含EDTA的无菌采血管在鸡翅下静脉采集2 mL血液，将血液用等体积PBS液稀释混匀，将稀释的4 mL血液缓慢加入4 mL淋巴细胞分离液层上，采用Ficoll密度梯度离心法（22 ℃，800 g，垂直离心30 min），收集中间层白色云雾状的外周血单核细胞（PBMC）。得到的细胞经5倍体积的PBS（4 ℃）洗涤2次（2 500 r/min，离心10 min），最后采用完全RPMI1640培养液洗涤1次（2 500 r/min，离心10 min）。将细胞重悬在1 mL含15%胎牛血清的完全RPMI1640培养液中，于37 ℃、5% CO2恒温培养箱中培养2 h，除去贴壁细胞，收集悬浮细胞。采用PBS缓冲液洗涤细胞2次（1 500 r/min，离心10 min），再用完全RPMI1640培养基重悬悬浮细胞，经台盼蓝染色，细胞存活率大于95%，采用细胞计数板计数并调整细胞浓度至5×106个/mL。试验分为5个组，即空白对照组（多糖质量浓度为 0 μg/mL）以及不同质量浓度多糖组，多糖组的终质量浓度分别为200、100、50、25 μg/mL。

1.4.2淋巴细胞cAMP和cGMP的测定

按上述方法分离培养淋巴细胞，调整细胞浓度至5×106个/mL。取6个24孔培养板，按以上分组，每组5个孔，每孔加入1 mL淋巴细胞悬液并加入多糖，使其终质量浓度分别达到200、100、50、25、0 μg/mL。将培养板置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养1、2、4 h，分时段离心收集细胞培养上清。按ELISA试剂盒说明书测定cAMP、cGMP的含量。

1.4.3淋巴细胞Ca2+、NO、iNOS的测定

按以上方法分离培养并分组，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h后，以 3 000 r/min 离心15 min，收集细胞上清液。采用ELISA法测定Ca2+、NO、iNOS的含量，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.4.4数据分析

各项免疫指标数据结果以“平均值±标准差”（x[TX-*5]±s）表示。采用SPSS 17.0軟件对各免疫性状结果进行单因素方差分析。统计分析结果均以α=0.05作为差异显著性判断标准。

2结果与分析

2.1中药复方多糖对cAMP、cGMP含量的影响

由表1可知，与对照组相比，试验组显著提高了细胞培养上清中cAMP、cGMP的水平（P<0.05）。当作用1 h时，与其他试验组相比，100 μg/mL多糖组的cAMP差异显著（P<0.05）；当作用2、4 h时，200 μg/mL多糖组的cAMP、cGMP分泌水平显著高于其他试验组。[FL）]

3结论与讨论

黄芪多糖能使小鼠脾淋巴细胞中cGMP浓度迅速升高，一定剂量的半枝莲多糖能使小鼠脾淋巴细胞内cAMP水平升高[6]。赵飞艳等研究表明，沙葱多糖可显著提高淋巴细胞内cAMP、cGMP含量[7]。本研究表明，一定纯度的中药复方多糖能显著提高淋巴细胞培养上清中cAMP、cGMP的水平，且cAMP、cGMP的平均水平随着时间的延长及中药复方多糖质量浓度的升高而增加，这与帅学宏等[8]、高建峰等[9]利用其他多糖的研究结果具有相似趋势。

钙离子是细胞信号转导的重要分子之一，对淋巴细胞信号转导和功能实现具有重要作用[10]。淋巴细胞钙离子水平直接影响淋巴细胞的分裂、巨噬细胞的吞噬作用并促进 IL-2 的释放等。研究表明，多糖可引起淋巴细胞内钙离子浓度的改变，从而调节机体免疫功能[11]。本研究表明，一定纯度的中药复方多糖能显著提高淋巴细胞培养上清中Ca2+的水平，这与刘媛等的研究结果[12]相一致。

一氧化氮（NO）是由一氧化氮合成酶（iNOS）催化，经多步氧化还原反应而生成的，在生物體内是一种重要的信使分子和效应分子[13]。张明等研究发现，适宜剂量的中药复方多糖（CPPS）能显著提高小鼠脾淋巴细胞的增殖活性和细胞培养液中的NO含量，提示CPPS可能通过NO介导信号通路，引起cGMP生成，进而发挥其免疫调节作用[14-16]。余桂朋等研究发现，艾叶多糖能增强巨噬细胞生成NO的能力，且在试验剂量范围内存在剂量-效应关系[17]。本研究表明，一定纯度的中药复方多糖能促进鸡外周血淋巴细胞中NO、iNOS的生成，这与韩杰等关于一定浓度刺五加多糖对体外培养的仔猪外周血淋巴细胞内NO、iNOS影响的研究结果[18]相一致。

一定纯度的中药复方多糖能通过提高细胞内Ca2+、NO、iNOS的水平来改变cAMP、cGMP分泌，影响免疫细胞信号的传导，从而发挥免疫调节作用。

参考文献：

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[7]赵飞艳，敖长金，萨茹丽，等. 沙葱多糖对绵羊外周血淋巴细胞信号转导相关分子的影响[J]. 细胞与分子免疫学杂志，2013，29（11）：1125-1128.

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[10]Paredes R M，Etzler J C，Watts L T，et al. Chemical calcium indicators[J]. Methods，2008，46（3）：143-151.

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[12]刘媛，赵红，蔡云，等. 马尾松花粉多糖硫酸酷化前后对小鼠脾细胞钙离子浓度的影响[J]. 药物生物技术，2011（5）：396-398.

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