农杆菌介导法转化金针菇不同受体的效率比较

材料非常广泛，包括真菌的孢子、菌丝和子实体等。王毅等以地衣型真菌（Cladonia metacorallifera）的菌丝为受体，成功地表达了外源绿色荧光蛋白[10]。值得关注的是，农杆菌介导法还可以应用于通过同源重组（homologous recombination）的基因编辑技术[11-13]，为研究真菌功能提供简便快捷的方法。

食用真菌中的金针菇（Flammulina velutipes）是一种营养丰富、功能多样的保健食品[14]。目前利用分子遗传手段培育高产稳产营养价值高的菌种是金针菇育种工作者普遍关心的问题。现有的报道中，关于金针菇的遗传转化主要有：以gpd启动子控制外源基因，担孢子为转化受体，电激法转化金针菇[15]；以trp1 为启动子，原生质体为转化受体，PEG介导法转化金针菇[16]，这两种方法的转化效率都非常低。李巍等报道了农杆菌的菌液浓度、侵染时间、乙酰丁香酮（acetosyringone，AS）浓度、共培养时间等因素对农杆菌转化金针菇的转化效率的影响[17]。受体材料对转化效率的影响在各种影响因素中亦是非常重要的，但是有关转化受体对转化效率影响的研究目前尚无报导。因此，笔者以金针菇单核体菌株Dan3和双核体菌株G1的菌丝碎片，以及Dan3和G1的原生质体分别作为转化受体，进行根癌农杆菌介导法转化金针菇，以期明确不同转化受体对根癌农杆菌介导法转化金针菇的影响，从而确定更适合作为金针菇转化受体的材料。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1菌株和质粒

金针菇（F. velutipes）单核体Dan3和双核体G1由上海市农业科学院食用菌研究所良种繁育中心提供，Dan3是G1的单核体亲本之一；大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α、根癌农杆菌（A. tumefaciens）LBA4404感受态购自上海迈其生物科技有限公司；双元表达载体pYN6982 由上海市农业科学院食用菌研究所遗传室提供[18]。

1.1.2酶和化学试剂

限制性内切酶XbaI、 XhoI购自美国Fermentas公司；凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒均购自美国Axygen公司；PDA、PDB粉末购自美国Becton公司；LB液体、固体培养基粉末购自生工生物工程（上海）股份有限公司；Taq聚合酶，DNA标准分子量，pMD19-T载体、菌体裂解液（Lysis buffer for microorganism to direct PCR）等购自日本Takara公司；潮霉素（Hyg）、卡那霉素（Kan）、利福平（Rif）、头孢噻肟钠（Cef）、乙酰丁香酮购自瑞士Roche公司；其他化学试剂均为国产分析纯。

1.2PCR引物设计

用限制性内切酶XbaI、XhoI双酶切载体pYN6982（具体操作参照内切酶说明书），将切下的潮霉素片段割胶回收（具体操作参照回收试剂盒说明书），连接pMD19-T载体并转化大肠杆菌DH5a（具体操作参照LBA4404感受态产品说明书），将菌液送至英潍捷基（上海）贸易有限公司测序，根据测序结果设计潮霉素检测引物：Hyg-F：5’-GATGTTGGCGACCTCGTATT-3’，Hyg-R：5’-TCGTTATGTTTATCGGCACTTT-3’，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3质粒转化农杆菌

取纯化的 pYN6982 质粒 DNA加入 100 μL感受态细胞中进行转化，具体操作参照LBA4404感受态说明书；随机挑取5个单克隆，进行PCR验证（反应体系参照Taq聚合酶说明书，反应条件：95 ℃， 5 min； 94 ℃， 30 s， 56 ℃， 30 s， 72 ℃， 40 s， 30 cycles； 72 ℃， 10 min； 4 ℃保存），对阳性克隆进行质粒提取和限制酶切验证（均参照说明书）。

1.4金针菇转化受体制备

1.4.1原生质体制备

将活化培养的Dan3/G1 PDA平板圆形菌丝块（D=3 mm）接种于100 mL PDB 培养基中，19 ℃，120 r/min培养 7 d，得液体菌种；用均质仪（Eberbac公司， 德国）在无菌条件下打碎，以10%接种量接种于 100 mL PDB中；19 ℃静置培养 4 d，期间间或摇匀；过滤，菌丝用 0.6 mol/L甘露醇溶液洗涤 2 次，再用吸水纸吸干。