锦鲤疱疹病毒—CJ株ORF108基因的克隆及生物信息学分析

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摘要：为研究我国锦鲤疱疹病毒的基因背景信息，从锦鲤疱疹病毒中国吉林株（KHV-CJ株）获得ORF108基因，应用生物信息学方法分析KHV-CJ株ORF108基因结构和功能。结果显示，ORF108基因长588bp，为一完整的开放阅读框，编码196个氨基酸，理论分子质量为21207.37Da。KHV-CJ株与美国株（KHV-U）的ORF108基因的序列一致性为99%，在第564位的碱基A突变为G。但该突变位置编码的氨基酸并没有发生改变，同为丝氨酸。ORF108基因编码蛋白的1-61位氨基酸位于细胞膜表面，62-84位氨基酸之间形成一个典型的跨膜螺旋区。该蛋白的表面抗原决定簇位点区域广泛、峰值高，预示该基因可作为基因工程疫苗的重要候选基因。

关键词：锦鲤疱疹病毒;ORF108基因;生物信息学分析

基金项目：长春市科学技术局先进实用技术的示范推广项目（12XN35）

中图分类号： S941.41                               文献标识码：  A                 DOI编号：   10.14025/j.cnki.jlny.2015.22.043

自从20世纪90年代末，锦鲤疱疹病毒病（Kioherpesvirusdisease，KHVD）就在普通鲤鱼和观赏锦鲤上发现并报道[1-2]。感染本病毒后病鱼聚集在进水口，身体出现白色斑块，皮肤呈现砂纸状纹理并变得粗糙。病鱼出现鳃和眼睛凹陷坏死等症状。

引起本病的病原较早称锦鲤疱疹病毒（Kio herpesvirus，KHV）。有人根据其病理变化又称为鲤肾炎鳃坏死病毒。2012年ICTV（国际病毒命名委员会）发布的第九次分类报告将本病毒命名为鲤疱疹病毒3型（Cyprinid herpesvirus 3，CyHV-3）。本病毒隶属于疱疹病毒目（Herpesvirales）异样疱疹病毒科（Alloherpesviridae）鲤疱疹病毒属（Cyprinivirus）成员。相关文献一般仍沿用锦鲤疱疹病毒这个名字。

鲤疱疹病毒属内还有鲤疱疹病毒Ⅰ型和鲤疱疹病毒Ⅱ型两种病毒。锦鲤疱疹病毒具有双链DNA基因组，是鱼类疱疹病毒属中基因组最大的病毒[3]，长达295kbp，有156个开放阅读框[4]。基因装在20面立体结构的核衣壳内，外面包裹来源于宿主的囊膜，囊膜上镶嵌病毒表达的糖蛋白。截至目前，病毒的基因有40个结构蛋白被鉴定。包括3个衣壳蛋白，13个囊膜蛋白，2个被膜蛋白以及22个未分类蛋白[5]。

感染本病毒初期鱼体内各组织均有病毒分布，然后病毒在几个组织和外周白细胞中持续感染，使得普通鲤鱼和锦鲤造成潜伏性感染[6]。当鱼在装载、运输等环境压力下，潜伏的病毒能被激活重新复制进入到细胞外面去，造成排毒并发病[7-8]。因此频繁的异地运输和贸易使得本病快速的传播[9]。锦鲤疱疹病毒病无论在人工养殖的普通鲤鱼和锦鲤中还是在自然水域中都普遍存在。本病死亡率最高可达100%，严重影响观赏锦鲤的全球贸易和鲤鱼养殖。鉴于锦鲤疱疹病毒病的严重性，联合国粮食及农业组织和世界动物卫生组织都将其列入到了水产养殖和食品资源安全威胁列表和必须呈报的疾病名单中[10]。

鲤鱼针对锦鲤疱疹病毒的免疫应答包括先天性免疫和适应性免疫。致病结果很大程度上应答是有利于病毒所采用的逃避策略还是宿主的免疫应答，理解这两个相反的过程可以帮助开发疫苗或治疗，采用合适的手段来控制本病。

锦鲤疱疹病毒病死亡率高，除预防接种外尚无有效的治疗方法[11]。对于病毒与机体的相互作用，机体对本病毒的应答机理也未明确。Michael Gotesman等针对TK基因和DNA聚合酶基因（TP）设计siRNA片段在体外进行实验，结果能有效减少病毒颗粒从CCB的释放[12]。

本研究以锦鲤疱疹病毒吉林株（KHV-CJ株）基因组为模板，利用PCR技术获得KHV膜蛋白ORF108基因，分析基因的生物学信息，目的是为我国锦鲤疱疹病毒的基因背景信息、分子流行病学及基因工程疫苗的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 毒株与试剂

KHV吉林株及锦鲤尾鳍原代细胞（KF-1）由本实验室保存[13]。

新生牛血清、L-15培养基;ExTaqDNA聚合酶、限制性内切酶EcoRⅤ和EcoRⅠ、10×ExBuffer、dNTPMix、DNAMarker、DNA胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒。

1.2 引物的设计及合成

依据GenBank上登录的KHV全基因组序列（GenBank：DQ657948.1）的ORF108基因序列，利用引物设计软件Primer Premiers 5.0设计引物如下：

ORF108P1：5"-GATATCATGGACACCAACTATACCAAC-3";

ORF108P2：5"-GAATTCTTACGATACAAAGGACTCGTC-3";

引物两端加EcoRⅤ和EcoRⅠ限制性酶切位点（划线部位）。

1.3 KHV-CJ株ORF108基因的PCR扩增

取1毫升KHV-CJ株病毒液与尾鳍原代细胞在22℃的条件下共培养。收集病毒并提取病毒DNA作为PCR模版，采用25μL反应体系进行PCR，循环温度和时间如下：95℃预变性5分钟;35个循环：94℃热变形1分钟、退火59.6℃ 30秒、延伸72℃ 1分钟;后延伸72℃ 10分钟。PCR产物低温保存。

1.4 KHV-CJ株ORF108基因的克隆及鉴定

回收PCR产物，克隆入pMD18-T载体，用EcoRⅤ和EcoRⅠ进行双酶切鉴定。筛选出的阳性质粒送至公司测序。

1.5 KHV-CJ株ORF108基因编码蛋白的生物信息学分析

将测序结果在GenBank中进行BLAST比对，利用软件DNAStar6.0翻译出ORF108基因的氨基酸序列;利用TMHMM Server v.2.0软件进行跨膜区分析;利用ProtScale软件分析蛋白质的疏水性;利用BepiPred1.0 Server软件和DNAStar6.0（Protean）对ORF108序列编码的蛋白进行抗原表位分析。

2 结果

2.1 ORF108基因的PCR扩增和鉴定

PCR扩增出一条约600bpDNA片段。将PCR产物回收，连接pMD 18-T载体，筛选的阳性重组质粒用限制性内切酶EcoRⅤ和EcoRⅠ进行双酶切鉴定（见图1），在588bp处和大于2000bp处各有一条带，说明目的基因克隆至pMD 18-T载体。测序结果表明：本实验室分离株与美国株同源性均为99%，表明通过PCR获得了KHV-CJ株的ORF108基因。

M：DL2000DNA Markers; 2： pMD18T-108的双酶切产物。

2.2 KHV-CJ株ORF108基因的生物信息学分析

2.2.1 测序结果的BLAST比对 将测序碱基序列在GenBank中进行核酸BLAST比对，鲤疱疹病毒3型中国吉林株（KHV-CJ）ORF108基因与美国株（KHV-U）的ORF108基因的序列一致性为99%，在第564位的碱基A突变为G。但该突变位置编码的氨基酸并没有发生改变，同为丝氨酸。

2.2.2 基因的序列和编码蛋白分子特征 ORF108基因长588bp，为一完整的开放阅读框，编码196个氨基酸，理论分子质量为21207.37Da，等电点为5.947，含有15个碱性氨基酸（K、R ）、18个酸性氨基酸（D、E）、77个疏水性氨基酸（A、I、L、F、W、V）和54个极性氨基酸（N、C、Q、S、T、Y）。

2.2.3 跨膜区分析 TMHMM预测（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）结果显示ORF108基因编码蛋白的1-61位氨基酸位于细胞膜表面，62-84位氨基酸之间形成一个典型的跨膜螺旋区（图2）。85-195位于细胞膜内部。

图2鲤疱疹病毒3型中国吉林株（KHV-CJ）ORF108的跨膜区分析序列的TMHMM预测后概率

2.2.4 疏水性分析 ProtScale在线分析（http：//web.expasy.org/

protscale/）表明（Hphob. / Kyte & Doolittle算法），ORF108基因编码蛋白具有一定的疏水性，ORF108最大疏水指数为3.256，最小疏水指数为-2.244。进入ProtParam工具（http：//web.expasy.org/protparam/），ORF108的总平均疏水值为0.127，其疏水区域大于亲水区域，可判断为蛋白疏水性蛋白。

2.2.5 抗原表位分析  利用http：//www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/在线软件和DNAStar 6.0（Protean）对锦鲤疱疹病毒ORF108序列编码的蛋白进行抗原表位分析，ORF108抗原表位主要集中在第12～17、99～104、117～120、161～168和187～192位氨基酸（图3），表明蛋白的表面抗原决定簇主要位于这些区域，预示这些抗原表位可能与该病毒的免疫原性有关。

图3鲤疱疹病毒3型中国吉林株（KHV-CJ）ORF108基因的抗原表位分析

3 讨论

针对锦鲤疱疹病毒ORF108基因编码的蛋白进行抗原表位分析，显示出该蛋白的表面抗原决定簇相对集中于后半段，峰值高。囊膜蛋白位于病毒的最外面，由于其曝露于血液当中常产较多的特异性抗体，因此可作为检测的特异性抗原。浆细胞产生的抗体通常仅仅识别一个抗原决定簇，而一个抗原决定簇仅有5～8个氨基酸组成，因此利用原核表达蛋白上的部分抗原决定簇可用来检测阳性抗体，也可以将其免疫动物制备抗体来检测病原。ORF108基因的分析提示其可以用来制备作为检测锦鲤疱疹病毒的备用基因。正确而详细地绘制蛋白质表位图谱，对定点改造蛋白质分子，设计疫苗分子结构及免疫干预治疗等具有重要意义。

KHV ORF108基因产物为囊膜蛋白[5]。通常囊膜蛋白与病毒的感染甚至病毒的毒力相关。对于囊膜病毒而言，通过其囊膜糖蛋白（Envelope glycoprotein）介导的病毒囊膜和宿主细胞膜的融合而启动病毒的侵染。囊膜病毒表面的蛋白与宿主细胞的受体结合后，引起了病毒融合蛋白构象发生变化，引起宿主通过胞吞导，病毒进入细胞导致病毒感染细胞。根据病毒的囊膜蛋白构象变化方式，可将囊膜病毒分为两类：Ⅰ型病毒膜融合和Ⅱ型病毒膜融合。Ⅱ型病毒膜分子机制不是很清楚。Ⅰ型病毒膜融合过程中，囊膜蛋白形成折叠的发夹三聚体结构时，缩短了细胞膜和病毒囊膜的距离，这一过程会释放能量，能量更促进膜融合。ORF108基因产物为Ⅰ型囊膜蛋白，分子大小约21kDa，质谱测试完全匹配上的肽段序列17.3%，protein score得分87。以上述理论研究为基础设计的C肽/N肽小分子抑制子，有可能通过结合囊膜与病毒受体产生竞争或者与囊膜蛋白结合后影响了蛋白的折叠使两膜之间的距离不能靠近从而阻止Ⅰ型囊膜蛋白的融合机制。这就为病毒疾病的防治提供了新思路和策略。

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作者简介：王好，博士，吉林农业大学动物科学技术学院，讲师，研究方向：动物病原学。