骨形成蛋白—2和牙胚细胞联合作用诱导人牙周膜干细胞表达成牙骨质细胞的表型研究

[摘要]目的：探讨大鼠牙胚细胞（Tooth germ cells， TGC）与骨形成蛋白-2 （Bone morphogenetic proteins-2，BMP-2）联合作用对人牙周膜干细胞（Human periodontal ligament stem cells， hPDLSCs）向成牙骨质细胞表型分化的作用。方法：将免疫磁珠法分离的hPDLSCs与TGC共培养，并加入50ng/mL的BMP-2，通过RT-PCR， 茜素红染色和碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase， ALP）活性检测等方法分析其相关成牙骨质基因及蛋白的表达变化。结果：诱导后hPDLSCs 的ALP活性明显升高（P<0.001），牙骨质细胞相关基因如牙骨质附着蛋白（Cementum attachment protein，CAP）、牙骨质蛋白（Cementum protein1，CEMP-1）、ALP，骨钙素（Osteocalcin，OCN）的转录水平表达量均有不同程度的增高（P<0.001）。矿化诱导14d后，诱导组形成大量矿化结节，与对照组相比具有统计学意义（P<0.001）。结论：TGC与BMP-2联合作用能够诱导hPDLSCs与向成牙骨质细胞的表型分化。

[关键词]牙周膜干细胞；骨形成蛋白-2；成牙骨质细胞；牙胚细胞

[中图分类号]R246.83 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2014）16-1343-06

Abstract： Objective To investigated the role of Bone morphogenetic protein-2 （BMP-2） as a factor to induce human periodontal ligament stem cells （hPDLSCs） differentiate into cementoblast or cementum like cells when co-cultured with tooth germ cells（TGC）. Methods hPDLSCs isolated by magnetic-activated method. The cells were co-cluture with tooth germ cells （control group） or co-cultured with tooth germ cells containing BMP-2（test group）.Then RT-PCR， Alkaline Phosphatase （ALP） analyses and mineralization assay were used to identify the cementoblast markers， such as CAP（Cementum attachment protein），CEMP-1（Cementum protein1），ALP and OCN （Osteocalcin）. Results The induced cells showed high ALP activity （P<0.001）， increased calcified nodules formation（P<0.001） and a significantly increase cementum-related genes expression such as CEMP-1，CAP，ALP and OCN （P< 0.001）. Conclusion hPDLSCs co-culture with TGC containing bone morphogenetic proteins-2 acquired more cementoblast features.

Key words：periodontal ligament stem cells； bone morphogenetic protein-2；cementoblast； tooth germ cells

牙骨质是覆盖在牙根表面的一薄层矿化组织，当牙骨质发生吸收或破坏时其自我修复能力有限，定向诱导hPDLSCs分化为成牙骨质细胞使牙骨质再生是牙周组织工程的重要内容。微环境[1]和细胞因子在牙周膜干细胞的增殖和分化过程中发挥着重要的作用，本研究拟将细胞因子和微环境联合作用来诱导hPDLSCs向成骨质细胞分化，为牙骨质的再生提供一些理论依据。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和仪器：主要试剂：α-MEM培养基（Gibco，USA），胎牛血清（FBS， Gibco， USA），胰蛋白酶（Gibco， USA），Ⅰ型胶原酶（Sigma，USA）， Dispase酶（Sigma，USA），免疫磁珠试剂盒 （Dynal biotech，USA），小鼠抗人STRO-1单克隆抗体、小鼠抗人CD146单克隆抗体、小鼠抗人角蛋白多克隆抗体、小鼠抗人波形蛋白单克隆抗体（Life Technologies，USA）；Hoechst（Sigma，USA）；BMP-2（Peprotech，USA）； ALP试剂盒（南京建成生物工程研究所）。主要仪器：倒置显微镜（Olympus， Japan）；免疫荧光显微镜（Leica Japan）；Real- time PCR 仪（Bio-Rad， USA）； 磁力架（Dynal biotech，USA）；Transwell （Milliport，USA）。

1.2 hPDLSCs的培养与分离[2]：遵循知情同意原则收集临床上因正畸需要拔除的牙周健康无龋的前磨牙，PBS反复冲洗牙齿，11号刀片快速刮下根中1/3部分的牙周膜，加入3mg/mL的Ⅰ型胶原酶和4mg/mL的Dispase酶，37℃消化1h， 70μm滤膜过滤器获得单细胞悬液， 将细胞接种于含10%FBS，2mmol/L L-谷氨酰胺和100μmol/L 维生素C的α-MEM培养基中， 37℃，5%二氧化碳孵箱中培养，每3天换液，细胞生长达80%时传代，取第2代牙周膜细胞，根据免疫磁珠试剂盒说明书分离hPDLSCs并扩增。

1.3 hPDLSCs的鉴定：采用免疫细胞化学染色方法对 hPDLSCs进行鉴定。将经磁珠法筛选获得的 hPDLSCs（+）和 hPDLSCs（-）细胞分别制作细胞爬片，4%多聚甲醛固定细胞，PBS清洗，1%BSA室温封闭30min，阻断非特异性结合，分别滴加STRO-1、CD146、角蛋白和波形蛋白一抗以及PBS，4℃孵育过夜。PBS冲洗，滴加荧光二抗，37℃染色45min，Hoechst染色5min，PBS清洗后荧光封片剂封片，免疫荧光显微镜下观察。

1.4鼠TGC的制备：选用5只出生后8天的Sprauge-Dawley大鼠，断颈处死，分离出下颌骨，体视显微镜下取出下颌骨中4个第一磨牙牙胚，去掉牙釉质，将牙胚组织剪碎后加入3mg/mL的 I型胶原酶和4mg/mL Dispase酶，37℃消化1h。将细胞接种于含10%FBS，2mmol/L L-谷氨酰胺和100μmol/L 维生素C的α-MEM培养基中，37℃，5%二氧化碳孵箱中培养，2～3天换液.细胞汇合达80%时备用。

1.5 hPDLSCs向成牙骨质细胞分化的定向诱导：诱导组将TGC和第3代hPDLSCs以2×105/mL接种至六孔板和Transwell进行共培养并加入含50ng/mL BMP-2的α-MEM培养基；对照组不加50ng/mL BMP-2，每隔1天换液。

1.6 ALP活性检测：分别收集实验组和对照组3，6，9d的细胞依照ALP试剂盒说明书进行ALP活性检测。

1.7 RT-PCR检测：分别收集诱导组和对照组3d的细胞，按照Trizol试剂盒说明书提取细胞总RNA，反转录成cDNA。根据 LightCycler R 480 SYBR Green I Master反应程序进行PCR扩增，检测CAP、OCN、ALP、CEMP-1基因的表达以GAPDH为内参照，引物设计见表1，由英伟创津公司合成。

1.8 茜素红染色：按上述分组将hPDLSCs以2×105/mL密度接种至诱导组和对照组，培养基中添加含10mmol/L的β-甘油磷酸钠进行矿化诱导，每隔2d换液，连续培养14d后， 4%多聚甲醛常规固定，PBS清洗，加入 0.1%茜素红染色30min后去除染色液，PBS润洗，相差显微镜下进行观察拍照，然后用含5% 十二烷基硫酸钠（SDS）的0.5N 盐酸溶液溶解着色的矿化结节30min，溶解液稀释10倍移至96孔板中，405nm波长测各孔吸光值。

1.9 统计学分析：所有数据采用SPSS16.0软件进行统计学处理。两组间样本均数比较采用t检验。

2 结果

2.1原代培养的PDLSCs，第2天开始出现贴壁生长，细胞多为长梭形，少量星形细胞，胞体丰满，胞质均匀，核圆形或椭圆形，位于细胞中央，细胞增殖能力强，5～6天即可达到瓶底覆盖率的80%（A）。经免疫磁珠分离的hPDLSCs胞浆被大量磁珠紧密包裹，贴壁生长2～3天后细胞伸展呈长梭形，磁珠贴合在细胞表面，不影响细胞生长，吹打或冲洗细胞以及传代后磁珠依然不脱落（ B），如图1。

2.2 hPDLSCs的免疫细胞化学染色结果示hPDLSCs（+）表达早期间充质干细胞表面标志物STRO-1（A）和血管周围细胞标志分子CD146（B）；hPDLSCs（-）不表达（C）和（D）。PDLSCs（+）和PDLSCs（-）细胞胞浆波形蛋白抗体染色均为阳性（E），角蛋白抗体染色均为阴性（F），说明所有细胞来源于间充质组织没有上皮细胞的污染。PBS染色的对照组里没有见到任何染色的细胞（G），说明筛选结果具有可靠性（如图2）。

2.3鼠TGC的制备，体视显微镜下出生后8天的SD大鼠下颌第一磨牙牙胚（A），倒置显微镜下观察到呈鹅卵石样的上皮来源细胞（B）和类似纺锤样的间充质来源细胞（C），及两种细胞的交界处（D）（如图3）。

2.4 ALP活性检测显示和对照组相比，经BMP-2和TGC联合诱导后，hPDLSCs的ALP活性明显升高（如图4）。

2.5 RT-PCR结果显示诱导后的hPDLSCs，牙骨质相关基因CAP、CEMP-1、ALP 和OCN的表达量较对照组均有明显升高，其中CEMP-1和ALP升高最明显（如图5）。

2.6 茜素红染色，将诱导组和对照组分别添加β-甘油磷酸钠矿化诱导14天后，诱导组表面形成大量的矿化结节（B），非诱导组仅有少量的矿化结节形成（A）。两组相比具有明显的统计学意义（C）（如图6）。

3 讨论

PDLSCs是牙骨质、牙周膜和牙槽骨再生的前体细胞[3]，是牙周组织再生的种子细胞[4]，干细胞的定向分化需要特殊的微环境和相关信号分子的联合作用[1，5]。如何有效诱导hPDLSC定向分化为成牙骨质细胞是牙骨质再生的研究难点和热点。

目前，关于牙骨质再生的研究主要集中在利用各种细胞因子的单向诱导作用，如牙本质非胶原蛋白（dentin non-collagen protein， DNCPs），BMP-2，釉基质蛋白衍生物（Enamel Matrix Derivative， EMD）等，并无法真正模拟成牙骨质细胞分化的微环境[6-9]。牙根发育是一个复杂的过程，在牙根发育过程中，当根部牙本质形成时，包绕牙根的上皮根鞘断裂成网状，牙囊细胞穿过断裂的根鞘上皮，进入新形成的牙本质表面分化为成牙骨质细胞。这个过程涉及复杂的调控信号，如上皮和间充质细胞间的交流信号，牙囊细胞和牙本质的接触信号等，为此越来越多的学者认为根端牙胚微环境在牙根发育中发挥着重要作用，有研究认为[10]，根端牙胚细胞培养液可以作为hPDLSCs向成牙骨质细胞分化的微环境，诱导后的hPDLSCs成骨或成牙骨质相关基因ALP和I型胶原酶（Type I collagen，Col I）的表达量明显增加，但牙骨质特异性蛋白CEMP-1和对照组相比没有明显变化，也没有发现骨涎蛋白（Bone sialoprotein， BSP）和OCN的表达。由此我们推测根端牙胚细胞是一个复合细胞群，含有上皮细胞和间充质细胞，它们一起混合培养是一个上皮细胞和间充质细胞交流的过程，可以为成牙骨质细胞的分化提供一定的微环境，但可能还需要更多的牙囊和牙本质的接触信号和其他相关信号因子的参与来弥补单一微环境或单一细胞因子诱导hPDLSCs向成牙骨质细胞分化的不足。BMP信号通路被认为在转录水平参与了PDLSCs向成牙骨质细胞的分化[11]，BMP-2，4，7会在上皮和间充细胞间进行转移，介导上皮和间充质之间的信号交流。许多研究[12-13]已报道BMP-2可促进牙槽骨、牙骨质和牙周韧带的再生。BMP-2可以诱导成牙骨质细胞的祖细胞（牙囊细胞）向成牙骨质细胞方向分化并刺激细胞表达牙骨质标志性蛋白CAP和（或）CEMP-1[14，7]，也可以诱导人牙周膜细胞中的祖细胞表达CAP，并认为BMP-2的最佳有效浓度是50ng/mL[15 ]。

利用根端牙胚作为诱导培养基时，根端牙胚的制取复杂，根端牙胚的界限也值得商榷，所得由牙囊细胞，牙乳头和上皮根鞘组成的根端牙胚细胞比例存在较大的人为因素的差异，所以本实验拟采用大鼠的整个牙胚细胞做为诱导培养基，而不是只局限于根端组织，从而优化诱导培养基的制备方法，为其提供更多的牙囊牙本质接触信号。据文献报道[16]，出生后8天的大鼠牙胚亨廷顿上皮根鞘（Hertwig"s epithelial root sheath，HERS）开始向根端延伸形成上皮根鞘，将牙囊细胞和牙乳头细胞分隔开，开始牙根的发育和形成，我们推测这个时期的牙胚细胞具有丰富的成牙骨质细胞分化相关的信号，另外牙乳头细胞可以分化为成牙本质细胞，形成牙本质及牙本质基质可以为我们提供更多的牙囊和牙本质的接触信号，因此本实验选用出生后8天的大鼠TGC，作为诱导微环境并添加50ng/mL的BMP-2诱导hPDLSCs向成牙骨质细胞分化。

牙骨质附着蛋白（CAP）[17-19]是一种细胞外基质蛋白，表达于牙骨质，牙周膜细胞和牙槽骨细胞，与成牙骨质细胞的祖细胞迁移并附着至牙根表面有关，因而被称为牙骨质附着蛋白，是目前已被公认的可以作为成牙骨质细胞与成骨细胞鉴别的特异性标志分子。CEMP1[20]作为一种成牙骨质细胞分化和类牙骨质机制矿化局部调节因子只在成牙骨质细胞和它的前体细胞及一些牙周膜细胞中表达，而在成骨细胞中不表达。它能促进成牙骨质细胞特异性标志物的表达而抑制PDLSCs向成骨细胞分化[21]。ALP[22]作为一种牙源性间充质细胞向成牙骨质细胞/成骨细胞分化的早期标志物，也是反应矿化形成细胞功能状态的重要指标。在本实验中，通过TGC和BMP-2的联合作用可以诱导hPDLSCs表达CAP、CEMP-1这两种牙骨质特异性基因，并且具有统计学意义（P<0.001），同时OCN和ALP的表达量较非诱导组也有了明显的升高（如图5）。ALP活性检测结果也从蛋白水平说明诱导组的ALP活性较对照组显著增高见（P<0.001），如图4；另外经过14天的矿化诱导，诱导组的矿化能力与对照组相比也有明显的升高见（如图6）。由此可见，TGC为hPDLSCs向成牙骨质细胞的定向分化提供了一个适宜的微环境，BMP-2作为信号分子介导了上皮和间充质之间的信号传导，从而使hPDLSCs表达成牙骨质细胞表型。

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[收稿日期]2014-06-08 [修回日期]2014-07-20

编辑/何志斌