Sox9和Ⅱ型胶原蛋白在人腰椎间盘退变中的表达及意义

[摘要] 目的 探讨Sox9和Ⅱ型胶原蛋白（Col2al）在人类腰椎间盘退变中的表达及意义。 方法 应用免疫组织化学在退变和正常腰椎间盘组织中分别检测Sox9和Ⅱ型胶原蛋白的表达，并分析其相关性。 结果 实验组Sox9染色阳性率为20.0%（6/30），对照组Sox9染色阳性率为76.7%（23/30），两组间染色阳性率有显著性差异（P<0.05）。实验组Col2al染色阳性率为33.3% （10/30），对照组Col2al染色阳性率为83.3% （25/30），两组间染色阳性率有显著性差异（P<0.05）。退变腰椎间盘中6例Sox9阳性者中，仅1例Col2al表达阴性，而在10例Col2al表达阳性者中，5例Sox9表达阴性，二者同时阳性5例，同时阴性表达19例。退变椎间盘中Sox9和Col2al的表达呈显著正相关（P<0.05）。 结论Sox9和Ⅱ型胶原蛋白表达降低与腰椎间盘退变有关， Sox9可能通过下调Col2al的表达，共同参与腰椎间盘退变。

[关键词] Sox9；Ⅱ型胶原蛋白；腰椎间盘退变；免疫组织化学

[中图分类号] R363.2 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2014）03-18-04

随着老龄化社会在中国的到来，颈、腰椎椎间盘退变所致颈肩痛、腰腿痛的发病率已逐渐增高，并且每年均要耗费相当的人力财力进行治疗。其治疗手段主要包括保守治疗和手术治疗，然而无论是脱水、镇痛、理疗等保守治疗还是各种微创或开放手术方法均不能从根本上阻止椎间盘退变的发生和发展，并且手术治疗还可能破坏脊柱运动的生理完整性，具有易复发、胃肠道反应等风险和并发症[1]。因此在已有研究基础上，针对椎间盘退变的靶点基因，通过基因治疗的方法来阻止或改变椎间盘退变，以成为颈腰椎疾病基础研究的热点课题之一。

Sox9（SRY related high mobility group box gene 9）基因最早是作为早期胚胎发育相关基因而被发现，但在之后的研究中逐渐被发现具有调控软骨细胞发育、成熟的重要功能[2-3]。比如在关节炎患者中致炎因子通过抑制Sox9的软骨调控作用，减弱病变软骨的再生和修复，从而引起关节炎迁延不愈[4]。而同样以软骨样细胞为主的椎间盘组织中Sox9基因的表达情况如何呢？我们采用免疫组织化学研究腰椎间盘退变临床标本中Sox9及其下游Col2al（Ⅱ型胶原蛋白）的表达情况，并探讨其机制，以期为分子水平预防和治疗人类椎间盘退变性疾病提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

选取2010年1月～2012年12月于我院住院因腰椎间盘突出症、腰椎滑脱、腰椎管狭窄等入院后路手术所取得的腰椎间盘患者30例作为实验组，患者年龄均>50岁，其中男16例，女14例，标本均经病理证实为退变椎间盘。选取腰椎外伤后路手术取出腰椎间盘标本30例作为对照组，患者年龄16～30岁，标本均经病理证实为正常椎间盘，其中男18例，女12例。

1.2 主要试剂

Sox9兔多克隆抗体、Col2al鼠抗人单克隆抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司，即用型超敏S-P免疫组化试剂盒、DAB显色液为福州迈新生物工程有限公司产品。多聚赖氨酸购自sigma公司。

1.3 实验方法

1.3.1 标本制备 标本均经4%多聚甲醛固定6～8h。常规脱水，石蜡包埋，4μm切片，采用HE染色和免疫组化染色。

1.3.2 免疫组织化学染色 采用S-P免疫组织化学染色超敏试剂盒，按期说明书进行实验。石蜡切片脱蜡至水，蒸馏水洗5min×2次，蒸馏水新鲜配制3%过氧化氢液，灭活内源性过氧化物酶，PBS洗3min×3次。将切片浸入0.01M枸橼酸盐缓冲液，微波炉加热沸腾，5～10min后，反复1～2次；PBS洗3min×3次，封闭血清37℃孵育10min；滴加一抗，4℃孵育12h，PBS洗3min×3次；滴加生物素标记的二抗，37℃孵育10min，PBS洗3min×3次；滴加链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液，37℃孵育10min，PBS洗3min×3次；滴加DAB显色剂，镜下确定反应时间终止。显色完成后，苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片；显微镜下观察染色结果。

1.3.3 染色结果的判断标准 Sox9位于胞核，Col2al位于胞浆，阳性细胞染色呈棕黄色，随机计数10个视野，阴性（-）判定为无阳性细胞或阳性细胞比例<10%，弱阳性（+）判定为阳性细胞比例10%～30%，中度阳性（++）判定为阳性细胞比例30%～60%，强阳性（+++）判定为阳性细胞数>60%。

1.4 统计学方法

采用SPSS15.0软件进行统计，两样本率的差别检验采用x2检验，相关性检验采用2×2列联表关联性分析，以α=0.05作为检验标准。

2 结果

2.1 退变腰椎间盘中Sox9的表达

阳性细胞胞核呈棕黄色（图1A）。实验组Sox9染色阳性率为20.0%（6/30），其中阴性（-）24例，弱阳性（+）2例，中度阳性（++）3例，强阳性（+++）1例。对照组Sox9染色阳性率为76.7%（23/30），其中阴性（-）7例，弱阳性（+）6例，中度阳性（++）10例，强阳性（+++）7例。两组间染色阳性率差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.2 退变腰椎间盘中Col2a1的表达

阳性细胞胞浆呈棕黄色（图1B）。实验组Col2al染色阳性率为33.3%（10/30），其中阴性（-）20例，弱阳性（+）5例，中度阳性（++）3例，强阳性（+++）2例。对照组Col2al染色阳性率为83.3%（25/30），其中阴性（-）5例，弱阳性（+）2例，中度阳性（++）10例，强阳性（+++）13例。两组间染色阳性率有显著性差异（P<0.05）。见表2。

2.3 退变腰椎间盘中Sox9表达和Col2al表达的关系

退变腰椎间盘中6例Sox9阳性者中，仅1例Col2al表达阴性，而在10例Col2al表达阳性者中，5例Sox9表达阴性，二者同时阳性5例，同时阴性表达19例。退变椎间盘中Sox9和Col2al的表达呈显著正相关（P<0.05）。见表3。

3 讨论

随着我国老龄化社会的到来，由椎间盘退变造成的颈、腰椎疾病发病率逐渐增高，并严重影响患者生活质量。研究发现，椎间盘退变是一系列脊柱退行性疾病的根本病理基础，其不仅表现为组织形态学的变化，而且表现为椎间盘基质生化组成与性质的系统性改变，并可直接导致椎间盘生物力学功能的减退和丧失，诱发脊柱不稳定的发生，其结局往往是椎管狭窄、脊柱节段不稳、骨赘形成、椎间盘突出及随之而来的神经根、脊髓受压等[5]，在中老年患者中，手术治疗存在风险和复发、神经功能损害等并发症。

目前来看，椎间盘退变的分子机理仍不完全清楚，但椎间盘组织中部分软骨调控相关基因表达异常导致的功能障碍与其相关[6]。Sox9基因最早是作为早期胚胎发育相关基因而被发现[7-8]，此外，Sox9发生基因突变（包括点突变、短尾突变等），将导致短指畸形，原因为正常的软骨形成过程被扰乱[9]。而在骨性关节炎患者，患处炎性因子表达明显增强，从而抑制Sox9基因的软骨生成作用，进一步减弱了病变软骨的再生和修复，成为炎症迁延不愈的重要原因[10]。表明Sox9基因也是调控软骨形成和功能的重要基因。本研究也发现在退变的人腰椎间盘组织中，Sox9的表达相对于正常椎间盘存在明显下调，同样的现象也在颈椎间盘退变标本中发生[11]，表明在Sox9的异常表达与人类椎间盘退变的确存在重要联系。但Sox9的表达下调究竟随着年龄是线性还是跳跃性进展仍不清楚，我们倾向认为线性进展。30～50岁之间的腰椎间盘突出发病率并不高，我们并未将之纳入研究，对此部分患者的研究可能回答上述问题，这是我们下一步工作的设想。

椎间盘的主要成分是水、胶原和蛋白多糖，正常情况下纤维环中含有60%Ⅱ型胶原和40%Ⅰ型胶原，因此胶原的退化和减少也是椎间盘退变的主要组成部分。软骨基质Ⅱ型胶原蛋白由Col2a1基因编码[12]，我们发现退变的人腰椎间盘组织中，Col2a1的表达相对于正常椎间盘也存在明显下调，Col2a1的低表达导致Ⅱ型胶原蛋白合成减少，软骨退化，修复降低，最终引起椎间盘退变。对于Col2a1和Sox9之间的关系，我们发现二者存在明显的正向相关，提示二者可能处于同一信号通路。事实上Sox9可通过转位入细胞核，直接结合Col2a1的增强子、或与其他蛋白形成转录复合体结合Cola1的启动子E-box等多种方式，调控其表达[13-15]。这些研究均表明Col2a1是Sox9的下游靶基因，转录因子Sox9基因可正向调控软骨细胞中Col2a1的表达，通过促进Ⅱ型胶原蛋白的表达而促进软骨的发育和成熟，而当退变发生Sox9基因表达降低时会下调Col2a1的表达而致Ⅱ型胶原蛋白合成减少，最终进一步加重椎间盘退变。

目前随着分子生物学等学科的迅速发展，基因治疗逐渐成为一种切实可行的治疗手段。有学者通过腺病毒介导的瞬时转染将重组BMP2（人骨形态发生蛋白2）导入兔椎间盘退变细胞，可引起Sox9的高表达，进一步增加Col2al的表达，从而增强Ⅱ型胶原及蛋白聚糖的表达合成[16-17]。而腺相关病毒介导的Sox9过表达可改善关节软骨的修复[18]，所以Sox9是一个逆转椎间盘退变的潜在基因治疗靶点。我们期望通过本项目的工作，能为治疗椎间盘退变提供了一条新的思路。

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（收稿日期：2013-12-09）