DR5上调在5—烯丙基—7—二氟甲氧基白杨素增强TRAIL诱导人肺癌A549细胞凋亡中的作用

摘要 目的：观察5烯丙基7二氟甲氧基白杨素（AFMC） ）是否协同肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）诱导人肺腺癌A549细胞凋亡.并探讨其机制是否涉及死亡受体5（DR5）的上调.方法：体外培养人肺腺癌A549细胞和人胚肺WI38细胞.碘化丙啶（PI）染色流式细胞术（FCM）定量分析细胞凋亡率；DNA琼脂糖凝胶电泳观察细胞DNA梯形条带；Western Blotting 检测DR5蛋白表达.结果：单独用亚毒性浓度的AFMC（1.0 μmol/L） 或TRAIL（30 μg/L）处理A549细胞，细胞凋亡率不超过5%.AFMC（1.0 μmol/L）联合TRAIL（30 μg/L）的A549细胞凋亡率增高（37.80%， P<0.01）；而WI38细胞仅有极少量的细胞凋亡（P>0.05）.DNA琼脂糖凝胶电泳显示：两者合用A549细胞呈现典型的DNA梯形条带图谱，而WI38细胞未出现DNA梯形条带；Western Blotting分析发现：AFMC呈浓度和时间依赖性上调A549细胞DR5的表达，DR5特异性抑制剂DR5/Fc嵌合蛋白能有效降低两者合用诱导的A549 细胞凋亡率（P<0.05）.然而，AFMC对WI38细胞DR5表达无明显影响.结论：亚毒性浓度的AFMC选择性增强TRAIL诱导人肺癌A549细胞凋亡.其机制可能与其上调 DR5表达有关.

关键词 肺癌；5烯丙基7二氟甲氧基白杨素；肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体；死亡受体5；细胞凋亡

中图分类号 R966 文献标识码 A 文章编号1000-2537（2014）01-0022-06

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TNFrelated apoptosisinducing ligand，TRAIL） 及其受体（“死亡”受体：DR4和DR5）属于肿瘤坏死因子（TNF）超家族成员，它具有选择性诱导多种肿瘤细胞及转化细胞凋亡，而对正常细胞没有明显细胞毒性的生物学特点，成为了一种极具发展潜力和应用前景的肿瘤靶向治疗因子.但有研究证实，超过50%的肿瘤细胞对TRAIL不敏感[1].庆幸的是，越来越多的实验结果表明TRAIL 与化疗或放疗药物联合治疗能克服大多数肿瘤细胞对TRAIL 的耐受并获得协同杀伤效应[2].

白杨素（5，7二羟基黄酮，ChR）是从多种植物、蜂胶和蜂蜜中提取的一种具有广泛生物活性的天然食源性黄酮.有研究报道指出：白杨素对非小细胞肺癌、恶性胶质瘤、子宫颈癌、白血病、食道鳞癌等多种肿瘤细胞具有良好的抗增殖活性和凋亡诱导作用，而对正常细胞未见明显毒性[3].但由于其肠道吸收甚少且5，7位羟基易被迅速糖基化代谢，导致该化合物的生物利用度降低，体内活性较低，因此，其应用受到限制[4].为此，作者以ChR为先导化合物，通过化学修饰得到ChR类似物5烯丙基7二氟甲氧基白杨素（5allyl7gendifluoromethoxy chrysin，AFMC）.在前期研究中，作者证明AFMC具有较ChR更强的诱导人肝癌HepG2细胞[5]、人卵巢癌CoC1细胞 [6]、人肺癌A549细胞[7]凋亡作用.

Ding等[8]证实白杨素能通过下调cFLIP，上调TRAILR2（DR5）增强TRAIL介导的白血病ATL、乳腺癌MDAMB231、结肠癌HT29、肝细胞癌HepG2、黑色素瘤细胞SKMEL37、胰腺癌Capan1等多种恶性肿瘤细胞凋亡.Jin等[9]报道白杨素类似物柚皮素通过上调DR5增强非小细胞肺癌A549细胞TRAIL耐药株对TRAIL的敏感性.本文研究亚细胞毒浓度的AFMC是否通过上调DR5表达，增强TRAIL诱导的A549细胞凋亡.

1材料和方法

1.1试剂

5烯丙基7二氟甲氧基白杨素（AFMC）按照文献[10]方法合成，分子式：C19O4H14F2；相对分子质量：344，性状：淡黄色晶体；纯度：99.0%.白杨素（ChR）和碘化丙啶（PI）为Sigma公司产品；重组人可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）由PeproTech公司生产；DNA Ladder检测试剂盒购于北京博大泰克公司；重组人DR5/Fc嵌合蛋白购自R&D Systems （Minneapolis，MN）.

1.2细胞培养

人肺癌A549细胞购自武汉大学中国典型培养物保藏中心（中国武汉）；人胚肺WI38细胞购自中国科学院细胞库（中国上海）.在37 ℃、5% CO2（体积分数，下同）及饱合湿度条件下，用含10%小牛血清，1667 mkat/L（即105 U/L）青霉素及1667 mkat/L链霉素的RPMI1640完全培养基传代培养，选取对数生长期细胞用于各项实验.

1.3流式细胞术分析

取对数生长期细胞用含10%小牛血清的培养基处理24 h进行细胞周期同步化后，分别加入含AFMC （1.0 μmol/L）、TRAIL（30 μg/L）以及两者合用的完全培养基孵育24 h；0.2% DMSO作为溶媒对照.收集细胞，加入PBS制备单细胞悬浮液， 再用冷却的PBS冲洗2次， 用70%酒精4 ℃ 固定24 h， PI染色后用流式细胞仪（American BD Company， FACS420）检测细胞凋亡.

1.4DNA琼脂糖凝胶电泳

收集各组细胞，PBS洗涤2次，按照DNA Ladder Detection Kit说明书操作，提取细胞DNA， 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段.

1.5Western Blotting分析

收集不同处理组细胞，PBS洗涤3次，用细胞裂解液（0.1 mol/L NaCl， 0.01 mol/L Triscl（pH 7.6）， 0001 mol/L EDTA（pH 8.0）， 1 mg/L Aprotinin， 100 mg/L PMSF）裂解细胞后提取细胞总蛋白.每组取25 μg蛋白样品进行10% SDSPAGE电泳（100 mA， 3 h），转移至PVDF膜上，用含5%脱脂牛奶的TBST室温下封闭2 h，然后分别加入1∶〖KG-2mm〗1 000稀释的DR5（p48）和βactin一抗，37 ℃孵育2 h；TBST缓冲液洗膜10 min×3次，加入相应的二抗室温孵育1 h后，TBST洗膜3次，每次15 min.ECL化学发光，显影，定影.实验中以βactin作为内参照蛋白.

1.6统计学分析

实验数据用SPSS 15.0软件包建立数据库（SPSS Inc， Chicago， IL），并进行统计学分析.数据表示为±s，经方差齐性检验后，用单向方差分析（One Way ANOVA）对多组均值进行比较，用LSD法对均值进行两两比较.P<0.05为差异具有统计学意义的标准.

2结果

21亚毒性浓度的AFMC、TRAIL及两者合用对人肺癌A549细胞凋亡的影响

PI染色FCM分析显示：1.0 μmol/L AFMC、30 μg/L TRAIL单用以及两者合用的A549细胞凋亡率（SubG1细胞百分率）分别为2.53%±0.35%，269%±0.52%，37.80%±1.78%.两者合用的细胞凋亡率是各自单用时细胞凋亡率之和的7.2倍（P<0.05，图1）.A549细胞凋亡率在两者合用12 h后开始增加，24 h达高峰（图2）.提示亚毒性浓度的AFMC能增敏TRAIL诱导人肺癌A549细胞凋亡.

22 亚毒性浓度的AFMC、TRAIL及两者合用对人肺癌A549细胞DNA断裂的影响

DNA琼脂糖凝胶电泳显示： 1.0 μmol/L AFMC或30 μg/L TRAIL分别作用于人肺癌A549细胞24 h，未见凋亡特异性的DNA梯形条带，而1.0 μmol/L AFMC预孵育30 min后，再加入30 μg/L TRAIL处理24 h，展现典型DNA梯形条带图谱（图3A）.进一步证实：亚毒性浓度的AFMC具有增强TRAIL诱导人肺癌A549细胞凋亡作用.

23AFMC对人肺癌A549细胞DR5蛋白表达的影响

Western Blotting分析表明：AFMC以浓度和时间依赖方式上调A549细胞DR5蛋白表达，DR5表达在AFMC作用6 h后开始增加，先于AFMC和TRAIL两者合用12 h后引起的细胞凋亡率增加（图4A，图5）.

24DR5拮抗性抗体对AFMC增强TRAIL诱导人肺癌A549细胞凋亡作用影响

DR5拮抗性抗体DR5/Fc嵌合蛋白能使亚毒性浓度AFMC和TRAIL合用的A549细胞凋亡率从37.80%±1.78%下降至7.61%± 0.32%（ P<0.05，图6），表明AFMC上调DR5表达是其增敏作用的机制之一.

25AFMC、TRAIL及两者合用对人胚肺WI38细胞的影响

1.0 μmol/L AFMC、30 μg/L TRAIL分别单用或两者联合处理人胚肺WI38细胞，其细胞凋亡率与溶媒组比较，差异均无统计学意义（P>0.05，图1）.AFMC、TRAIL无论单用或合用于WI38细胞24 h，均未呈现凋亡特异性的DNA梯形条带（图3B）.AFMC对WI38细胞DR5表达无明显影响（图4B）.说明：亚毒性浓度的AFMC 对TRAIL诱导凋亡的增敏作用具有肺癌细胞选择性，与其选择性上调肺癌细胞DR5 表达有关.

3讨论

肺癌系全世界最常见的恶性肿瘤之一，全世界每年约有100～130万患者死于肺癌.我国卫生部2008年4月29日公布的第三次全国居民死亡原因调查显示，过去30年间我国肺癌死亡率上升了465%，肺癌已位居我国恶性肿瘤死亡率之首.其中约80%的肺癌患者为非小细胞肺癌（NSCLC），NSCLC发病隐匿，早期不易诊断，确诊时多为中、晚期，已丧失手术良机.目前治疗NSCLC的药物因其非选择性杀伤作用和较强的毒副反应，临床应用受限.临床仍采取以化疗为主的综合治疗，但5年生存率仍低于15%，并且极易复发、转移[11].寻求高效、低毒的新型抗肺癌药物是当前肿瘤防治研究的热点.

TRAIL是1995年发现的与FasL和TNFα有较高同源性的TNF超家族成员.它们都能与靶细胞膜上特异性DR4和DR5受体结合，通过多种死亡信号转导途径诱导靶细胞凋亡.与TNF、FASL不同，TRAIL能选择性诱导肿瘤细胞、转化细胞、病毒感染细胞凋亡，而对肝细胞、骨髓细胞等正常细胞几乎无毒性.大量临床前实验证实TRAIL能有效地诱导多种肿瘤细胞系凋亡 [12].然而随着研究的深入，越来越多的肿瘤细胞尤其是一些恶性肿瘤对TRAIL存在先天性或获得性耐受[2].如何有效逆转肿瘤细胞对TRAIL的凋亡抵抗是当前亟待解决的问题.研究表明，细胞表面DR4和DR5的表达水平是决定肿瘤细胞对TRAIL敏感性的关键，而且在正常37 ℃的生理条件下， TRAIL与其受体结合，DR5的亲和力最强，从而在TRAIL诱导的凋亡通路中发挥最大作用[13].如何上调DR尤其是DR5的表达，增强肿瘤细胞的TRAIL敏感性，充分发挥TRAIL的选择性杀伤效应成为近年研究的热点.

作者前期研究通过细胞毒实验确定了AFMC和TRAIL的亚毒性（细胞毒性<15%）浓度，证实人肺癌A549细胞对TRAIL耐药且AFMC能选择性增强TRAIL对A549细胞毒作用[14].那么，这种细胞毒增敏效应是否通过诱导细胞凋亡实现？本文通过FCM分析和琼脂糖凝胶电泳证明，亚毒性浓度的AFMC与TRAIL联用能协同诱导A549细胞凋亡.文献报道[8]，白杨素能通过上调DR5表达增强TRAIL对多种恶性肿瘤的凋亡诱导作用.前期研究中，作者发现不同浓度AFMC对A549细胞DR4的表达未见明显影响.Western Blotting检测AFMC呈浓度和时间依赖方式上调DR5表达.DR5拮抗性抗体DR5/Fc嵌合蛋白能使AFMC和TRAIL合用的A549细胞凋亡率显著下降.提示DR5的表达上调是AFMC增敏TRAIL诱导A549细胞凋亡的机制之一.前期研究表明AFMC和TRAIL合用对永生化二倍体人胚肺WI38细胞无明显细胞毒性，本文同样证实了两者合用对WI38细胞无明显凋亡诱导作用，且AFMC对WI38细胞DR5表达无影响.综合以上结果作者推测：AFMC选择性增敏TRAIL 诱导人肺癌A549细胞凋亡，与其上调DR5 表达有关.关于AFMC如何上调DR5的具体机制仍有待深入研究和探讨.本文结果可为将天然食源性黄酮化学改造，开发基于TRAIL抗肿瘤治疗提供新途径.

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（编辑王健）