茄子冷诱导转录因子CBF的分离及分析

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摘  要  利用白菜CBF基因序列搜索茄子基因組DNA序列和茄子EST序列，然后参考这些序列设计开放型阅读框两端的特异引物，以茄子叶片cDNA为模板克隆获得了该基因的cDNA序列。经生物信息学分析证实该序列是CBF基因，命名为SmCBF（登录号：KY780486.1）。该基因编码211个氨基酸，包含AP2功能域和DNA结合位点，属于AP2超基因家族。用PlantCARE分析SmCBF基因启动子序列的顺式作用元件，发现了1个MYC识别位点和1个MYB结合位点，说明该基因受到MYC和MYB的调控。采用Real-time PCR研究了SmCBF基因在低温诱导茄子中的表达情况，结果显示该基因随着低温处理时间延长表达量逐渐升高，在6 h达到最高值，说明低温诱导该基因表达。

关键词  茄子;CBF基因;基因克隆;荧光定量PCR;启动子中图分类号  S641.1      文献标识码  A

Isolation and Analysis of Cold-induced Transcription Factor CBF from Solanum melongena

JIANG Tao^1，2， SHEN Yanhong¹， ZHAO Wanwan²， LIN Biying^2*

1. College of Horticultural Science and Technology， Hebei Normal University of Science and Technology， Qinhuangdao， Hebei 066604， China; 2. College of Horticulture， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China

Abstract  The sequence of the open reading frame of CBF was obtained from reference Solanum melongena genomic sequence in NCBI using the the sequence of CBF gene from Chinese cabbage as a query. The full-length cDNA of CBF was isolated from the leaf of eggplant （primers were designed according to the genome DNA sequence and the EST sequence）， and the cloned gene was designated as SmCBF （GenBank No： KY780486.1）. Using bioinformatic analysis， the gene was identified as a member of the AP2 gene family， which encoding 211 amino acids with DNA binding site. The cis-acting elements of the promoter sequence of SmCBF gene were analyzed by PlantCARE. One MYC recognition site and one MYB binding site were found， indicating that MYC and MYB might be involved in regulating the expression of SmCBF. Real-time PCR analysis revealed that the expression level of SmCBF gene increased gradually with the prolongation of low temperature treatment time and reached the highest value at 6 h， indicating that SmCBF was induced by low temperature treatment.

Keywords  eggplant; CRT binding factor; gene clone; quantitative real-time PCR; promoter

DOI  10.3969/j.issn.1000-2561.2019.09.013

茄子（Solanum melongena）是亚洲和非洲许多国家重要的蔬菜作物之一，在我国各地普遍栽培。茄子作为一种喜温性蔬菜，大多茄子品种不抗寒^[1]。近年来，人们采用节能型塑料日光温室和塑料大棚在冬春反季节栽培茄子。然而由于我国的棚室结构一般比较简单，在冬春严寒季节，低温仍然是影响茄子产量和品质的主要因子。尤其是冬季极限低温和霜冻给茄子生产带来巨大损失。2016年1月的低温霜冻，给福建省闽东闽南春早熟设施茄子造成了严重的损失，泉州以北的春早熟设施茄子几乎全军覆没;漳州和厦门茄子生产也因低温而严重减产。因此研究茄子的耐寒性，寻找抗寒基因，培育耐低温品种，对茄子产业意义重大。

植物抗寒性是由基因控制的，寒冷信号会诱导特定基因表达，提高植物的抗寒能力。通过基因工程方法将抗寒相关基因导入植物中能提高植物的抗寒性。CBF（CRT/DRE binding factor）是抗寒相关基因COR（cold-regulated）的转录激活因子，是Stockinger等^[2]在拟南芥中首次发现，该基因的蛋白表达产物可以和具有CRT/DRE元件的基因结合，在植物耐寒等抗逆反应中起着“开关”作用，调控下游大量抗冷基因的表达，对增强植物的抗冷能力极为重要。过量表达CBF基因能活化所有带CRT/DRE元件的冷诱导基因表达，提高抗寒性。目前已经在拟南芥（Arabidopsis thaliana）^[2-3]、番茄（Lycopersicon esculentum）^[4-5]、水稻（Oryza sativa）^[6]等多种植物中发现CBF对抗冷能力的调节作用。本研究克隆茄子CBF基因，并分析了CBF基因序列特性和冷诱导表达情况，为进一步利用基因工程培育茄子抗寒品种提供基因资源。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  植物材料  将T40茄子6叶龄幼苗放在3 ℃培养箱中进行低温处理，于0、2、6、12 h分别取样。将茄子第5片真叶取下立即投入液氮中，−80 ℃保存备用。

1.1.2  试剂与菌株  ExTaq、pMD18-T、T₄ DNA连接酶载体购自TaKaRa公司;柱式DNA胶回收试剂盒购自北京天恩泽基因科技有限公司;SYBR ExScript^TM RT-PCR购自TaKaRa公司;引物由上海铂尚生物技术有限公司合成。通用RNA提取试剂盒R1051购自广州东盛生物科技有限公司。E. coli DH5α菌株由本实验室培养并保存。其余为国产分析纯试剂。

1.2  方法

1.2.1  茄子CBF基因的克隆与生物信息学分析

将白菜（Brassica rapa）CBF基因序列（登录号：KJ013591.1）搜索茄子基因组DNA序列，用softberry网站在线预测基因软件FGENESH对这段DNA序列进行基因预测，找到CBF基因的编码区。参考茄子EST序列，通过与小白菜（Brassica campestris）、番茄（Solanum lycopersicum）、马铃薯（Solanum tuberosum）CBF基因序列比对确定茄子CBF的开放型阅读框区域（Open Reading Frame， ORF），并在此序列基础上设计ORF上下游引物和荧光定量引物（表1）。

参考RNA提取试剂盒步骤提取茄子叶片总RNA，将500 ng RNA逆转录合成cDNA。吸取cDNA 1 μL作为模板进行PCR扩增，25 μL PCR反应体系包含2.5 μL Ex buffer，2 μL dNTPs，0.2 μL ExTaq，0.5 μL引物，1 μL cDNA，ddH₂O補充至25 μL。扩增程序为94 ℃预变性3 min;35个扩增循环的94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min;最后72 ℃继续延伸7 min。然后，将PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，将含有目的条带片段割胶回收，再连接pMD18-T载体，转化到大肠杆菌感受态细胞中，挑选阳性克隆送到铂尚生物技术有限公司进行测序。

用DNAMAN 6.0软件进行基因片段的拼接和蛋白质翻译;用Primer 5.0软件进行引物设计;用MEGA 6.0软件的邻接法（Neighbor-Joining， NJ）构建分子进化树。基因同源性搜索、基因预测、转录因子分析及蛋白质结构分析均使用在线数据库，网址见表2。

1.2.2  茄子CBF基因启动子顺式元件分析  将SmCBF基因序列与茄子基因组DNA序列进行比对，截取起始密码子ATG上游的DNA序列即为SmCBF基因启动子序列。用PlantCARE在线工具分析该段序列的顺式作用元件。

1.2.3  茄子CBF基因在低温诱导茄子中的表达分析  提取3 ℃低温处理后0、2、6、12 h幼嫩叶片的总RNA，分别取500 ng逆转录为cDNA。在CBF基因3′端非保守区设计引物qCBF-F和qCBF-R，以茄子Actin基因为内参，用Bio-RAD进行荧光定量PCR扩增。反应体系为20 μL：SYBR Premix Ex Taq^TM 10.0 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA 1.0 μL，ddH₂O 8.0 μL。扩增程序为95 ℃预变性3 min，40个循环的95 ℃变性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s。每个样品3次重复，采用2^-ΔΔCT法分析数据。以0 h为对照，分析CBF基因在低温诱导后的相对表达。用Excel软件进行分析和作图。

2  结果与分析

2.1  茄子CBF基因的克隆与同源性分析

在NCBI上用白菜CBF基因序列（登录号：KJ013591.1）搜索茄子Whole-genome shotgun contigs，发现该序列与茄子contig： Sme2.5_ 04750.1_1（登录号：BAUE01047055.1）相似度最高，达71%。在softberry网站，以番茄基因组DNA为参照，用FGENESH软件对该序列进行基因预测，在1023～2137 bp之间有1个没有内含子的基因。将该基因序列与Genbank登录的基因组序列，以及3个EST序列（EST1：FS056692.1;EST2：JZ716995.1;EST3：FS057826.1）进行比对，设计ORF引物CBF-U与CBF-D（表1）。

以茄子叶片cDNA为模板，用CBF-U和CBF-D引物进行扩增，获得长约700 bp的片段（图1）。经回收、测序长699 bp，与基因组DNA序列完全一致。将此序列及其编码的氨基酸序列与其他物种CBF比较，发现有较高同源性，该序列（Solanum melongena，AVC18973.1）与辣椒（Capsicum annuum，NP_001311786.1）、烟草（Nicotiana tabacum，NP_001312746.1）、番茄（Solanum lycopersicum，XP_004234350.1）、马铃薯（Solanum tuberosum，ACJ26754.1）和葡萄（Vitis vinifera，XP_002280097.1）的CBF蛋白同源性为71.17%、70.09%、65.93%、63.76%、62.84%（图2）。因此确认获得了茄子CBF基因全长cDNA序列，将其命名为SmCBF，GenBank登录号为KY780486.1。将茄子CBF氨基酸序列在NCBI网站的CDD搜索进行氨基酸序列结构域分析，发现该蛋白质包含AP2功能域，属于AP2超基因家族，11个保守的氨基酸残基是DNA结合位点（图2）。PlantTFDB转录因子分析也确认该蛋白含有DNA结合位点，能够响应干旱和低温，提高植物的抗逆性。

2.2  茄子CBF蛋白的基本理化性质和结构预测

将茄子CBF基因的cDNA序列翻译成氨基酸序列，编码211个氨基酸。Protparam分析可知，蛋白质分子式为C₁₀₄₃H₁₆₀₀N₂₈₀O₃₃₀S₁₀，等电点为4.90，分子量约为23 662.46 ku。用SignalP 3.0 Server进行信号肽预测，发现没有信号肽序列，不是分泌蛋白。不稳定系数为65.26，属于不稳定蛋白。蛋白跨膜预测表明为非跨膜蛋白。SmCBF蛋白二级结构的预测显示，α-螺旋（36.97%）、随机卷曲（43.13%）、β-转角（5.21%）和延伸链（14.69%）交替分布（图3）。

2.3  茄子CBF蛋白的分子进化分析

利用MEGA6.0的NJ法，將SmCBF与其他12个高等植物的CBF基因的氨基酸序列构建分子进化树。结果表明，茄子CBF与同一属的番茄和马铃薯CBF蛋白相似性很高，与同一科不同属的辣椒和烟草相似性较高，与单子叶植物水稻亲缘关系最远（图4）。

2.4  茄子CBF基因启动子顺式作用元件分析

将SmCBF基因起始密码子ATG上游长度为1099 bp的DNA序列，用PlantCARE分析启动子顺式作用元件，结果见表3。SmCBF基因启动子顺式作用元件主要有1个MYC识别位点、1个MYB结合位点、1个水杨酸应答元件、2个赤霉素应答元件、3个乙烯响应元件和5个光应答元件。这说明茄子SmCBF基因表达受到MYC、MYB、水杨酸、赤霉素、乙烯和光照等因素的调控。

2.5  茄子CBF基因在低温诱导茄子中的表达分析

采用Real-time PCR研究了SmCBF基因在低温诱导茄子中的表达情况，结果显示，该基因随着低温处理时间延长表达量逐渐升高，在6 h达到最高值，约为未处理时的500倍，在处理后的12 h表达量稍有降低，但仍远高于0 h，说明低温促进该基因表达量升高，可能参与茄子的低温驯化（图5）。

3  讨论

低温逆境是影响植物生长发育和分布的主要因素之一，每年因寒害造成的园艺作物的减产和品质下降是目前园艺植物生产中亟待解决的一大难题。植物的抗寒性一般受多基因控制，且与品质优劣性状紧密连锁，因此采用常规杂交育种很难提高植物抗寒性。利用基因工程改良植物的抗逆性为抗性育种开辟了新途径，因此抗逆基因的克隆与分析就显得极为重要。抗寒基因可分为结构基因和调控基因两大类。结构基因是植物抗寒性直接相关的基因，如冷诱导基因、抗氧化酶基因和脂肪酸去饱和酶基因等^[7];调控基因是通过调控结构基因的表达、寒冷信号传导等过程来提高植物的耐寒性，如CBF、ZAT10、ICE、b-ZIP、WRKY、NAC等基因^[7-9]。CBF转录因子在植物抗寒中具有重要的调节作用^[3]。拟南芥CBF基因缺失型突变体植株的抗冷能力显著下降，反义CBF1和反义CBF3拟南芥半致死温度比野生型高1.5 ℃^[10]。将CBF基因导入拟南芥、苹果和草莓中，能够在一定程度上提高植株的抗寒性^[11-13]。CBF转录因子大量表达能提高植物的抗寒性，是由于它可以特异性地识别并结合DRE/CRT顺式作用元件，调控RD17、COR6、KIN2和COR15A等多種基因的表达，而提高植物的抗冻能力^[14]。同时，CBF的表达也受到上游基因调控。茄子SmCBF启动子顺式作用元件分析显示，包含1个MYC识别位点和1个MYB结合位点。在拟南芥中，bHLH转录因子（inducer of CBF expression 1，ICE1）可以识别MYC位点，MYB15则与MYB结合位点结合，MYB15与ICE1相互作用共同调节CBF的表达^[15-16]。

本研究克隆了茄子CBF基因，命名为SmCBF。该基因编码211个氨基酸，包含AP2功能域和DNA结合位点，属于AP2超基因家族。功能域分析和转录因子分析表明，该基因参与植物的应激胁迫反应和植物的低温驯化过程。茄子CBF蛋白与同一属的番茄和马铃薯CBF蛋白相似性很高。采用Real-time PCR研究了SmCBF基因在低温诱导茄子中的表达差异，结果显示该基因随着低温处理时间延长表达量逐渐升高，在6 h达到最高值，表达量是未处理时的500多倍。CBF基因家族成员在很多植物中都能够很快响应低温诱导，低温15 min即可诱导拟南芥AtCBF基因的表达，2 h后达到表达高峰^[17];棉花GhDREB1表达高峰也在2 h^[18];黑麦草CBF的表达高峰为2～4 h^[19]。低温诱导能够大大提高茄子SmCBF基因的表达量，说明该基因在茄子低温胁迫应激反应中具有重要作用。茄子SmCBF基因的分离，以及编码蛋白特性和表达模式的分析，为进一步利用该基因开展抗寒育种提供基因资源和参考。

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