橡胶树COP9家族基因的克隆及表达分析

摘  要  COP9信号小体（CSN）是进化上保守的蛋白复合体，在茉莉酸信号途径中起着重要的作用。橡胶树的乳管是一种特化的细胞器，是天然橡胶合成和储存的场所。现有的证据表明橡胶的生物合成可能受到茉莉酸信号途径的调控，但是对于茉莉酸信号途径调控天然橡胶的生物合成还了解的不够。本研究采用RACE技术结合RT-PCR从胶乳中克隆了8个CSN基因的全长cDNA序列，根据与拟南芥的相似性，分别命名为HbCSN1～HbCSN8。荧光定量PCR结果显示，8个CSN基因均能在树皮、不同发育时期的叶片、胶乳、雄花和雌花中表达，其中HbCSN5在胶乳中的表达量最高，其他成员在叶片中的表达量最高。而且，部分HbCSNs基因在胶乳中的表达受到割胶和茉莉酸甲酯处理的上调表达。因此，推测这些上调表达的成员可能参与胶乳的茉莉酸信号途径。

关键词  巴西橡胶树;COP9信号复合体;基因克隆和表达分析;进化树分析

中图分类号  S794.1      文献标识码  A

COP9信号小体（COP9 signalosome）又称CSN复合体，是一种进化上高度保守的多亚基蛋白复合体[1-2]。最初是邓兴旺等生物学家于1992年在拟南芥光形态建成的研究的过程中，采用T-DNA标签技术，分离筛选到一系列突变体，这些突变株由于相应基因的缺失导致暗中的生长植物呈现出一种类似于光下生长的状态，并克隆了COP1基因。随后，他们又克隆了其他COP成员[3-6]。CSN也在多种有机体中相继被发现，并且证实CSN复合体参与调控多个重要的生物过程。在高等真核生物，COP9信号小体由8个CSN成员组成，分别命名为CSN1～CSN8，其中6个亚基CSN1、CSN2、CSN3、CSN4、CSN7和CSN8含有PCI（Proteasome， COP9 signalosome and eIF3）結构域[7]。另外2个亚基CSN5和CSN6含有MPN（Mpr1-Pad1-N-terminal）结构域[6， 8]。在植物中，CSN一个主要的功能就是参与蛋白的降解。作为泛素-蛋白酶降解系统的组分，CSN通过移除cullin蛋白中的NEDD8（neural precursor cell- expre ssed developmentally dowegulated-8，植物中也称为RUB（RELATED TO UBIQU IT IN））来调控cullin- RING E3泛素连接酶的活性[8-12]。通过这种方式，CSN与SCF（SKP1-CUL1-F-box-type CRLs）复合体协作参与多种信号转导过程，在植物的生长发育、次生代谢调控中起着重要的作用。如CSN与SCFTIR1互作参与植物生长素信号途径[10， 13];CSN与SCFUFO互作参与花发育[14];CSN与SCFCOI1互作参与茉莉酸信号途径[15-16];CSN与SCFSLY1互作参与赤霉素的信号途径[17-18];CSN与SCFCFK1互作参与种子的发育[19]。

在天然橡胶生产中，人们通过有规律地重复切割橡胶树树干树皮（割胶），切断树皮中的乳管，多次收集从乳管伤口处流出的乳汁状的胶乳来提炼橡胶。割胶显著促进橡胶树胶乳的合成，割胶树的胶乳内源茉莉酸含量显著高于未开割树，橡胶合成效率显著高于未开割树，外施茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate，MeJA）促进胶乳的生物合成，并鉴定了茉莉酸信号途径的核心环节HbCOI1- HbJAZ3-HbMYC2及其对法尼基焦磷酸合酶和小橡胶粒子膜蛋白基因的转录调节[20]。这些结果表明，割胶促进橡胶生物合成与激活茉莉酸信号传导途径有密切联系。为了进一步丰富和了解茉莉酸信号途径在橡胶生物合成中的作用，本文克隆了COP9信号小体的8个CSN成员并进行了组织特异性表达分析及割胶和茉莉酸甲酯处理的基因表达模式。

1  材料与方法

1.1  植物材料及处理

巴西橡胶树（Hevea brasiliensis Muell. Arg.）为热研73397品系，种植于中国热带农业科学院实验场。组织特异性表达的样品的采集：于同一天分别采集3株树的树皮、古铜期叶、淡绿期叶、成熟期叶、胶乳、雄花和雌花混合后置于液氮中用于RNA的提取。割胶处理样品的采集：选取3株8 a树龄的未开割树，采用S/2 d/3（1/2树围，3 d 1刀）的割制进行连续割4刀，收集每刀的胶乳样品于RNA提取液中用于RNA的提取。茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate，MeJA）处理样品的采集：参照郝秉中等[21]的方法，用0.07% MeJA分别处理橡胶树萌条第三伸长单位，于处理后2 h、4 h、8 h、1 d、2 d、3 d划破受伤部位的树皮采集胶乳，每一处理分别采集9株萌条的胶乳混合于RNA提取液中用于RNA的提取，对照为灭菌水处理萌条的胶乳样品。

1.2  方法

1.2.1  RNA的提取及cDNA的合成  采用RNAprep Pure Plant Kit（天根生化科技（北京）有限公司，北京）提取不同组织样品的RNA，并采用试剂盒附带的DNase I进行痕量DNA的消化。采用NanoDrop 2000 （Thermo Fisher Scientific， USA） 测定RNA的浓度，并用RevertAid™ First Strand cDNA Synthesis Kit （Thermo Fisher Scientific， USA）对RNA进行反转录合成第一链cDNA。

1.2.2  HbCSN基因的克隆  将拟南芥AtCSNs的序列同热研8-79的转录组序列（http：//www.ncbi. nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi？acc=GSE59981.）[22]进行同源性比对，获得8个HbCSNs的unigene序列。这8个unigene序列缺失5′端序列，HbCSN1、HbCSN2、HbCSN4和HbCSN6缺失3′端序列。为了获得完整的全长cDNA序列，采用SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit （Clontech， USA）试剂盒对HbCSNs序列进行了RACE（rapid-amp lification of cDNA ends）实验，引物如表1。对于5′-RACE，采用试剂盒附带的5′-CDS primer A和SMARTer II A oligonucleotide对1 g总RNA进行反转录，获得用于5′-RACE的cDNA。对于3′-RACE，采用3′-RACE CDS Primer A按照试剂盒说明对1 g总RNA进行反转录，获得用于3′-RACE的cDNA。以获得5′-RACE和3′-RACE cDNA为模板，采用PrimeSTAR Max Premix （TaKaRa， Dalian， China）进行5′和3′端序列的扩增。将获得的5′和3′端序列与unigene序列进行拼接，并设计全长cDNA扩增引物（表1），进行PCR扩增验证。