地中海贫血基因诊断研究

摘要：地中海贫血是一组因珠蛋白肽链合成障碍而导致的遗传性溶血性贫血，目前对地中海贫血尚无有效的治疗方法。基因诊断是通过对受检者某一特定基因（DNA）或某转录物（mRNA）进行分析来诊断遗传病的技术，已成为最为普遍的地中海贫血常规检测方法，又被称为是诊断地中海贫血的金标准。本文综述了地中海贫血基因诊断的研究进展。

关键词：地中海贫血；基因诊断

地中海贫血（Thalassemia）是由于血红蛋白基因的突变导致珠蛋白链的合成不平衡所造成的一类常见的单基因遗传性、溶血性疾病。包括α地中海贫血和β地中海贫血两种类型，是世界上最常见和发病率最高的遗传性溶血性贫血，也是危害最严重的血红蛋白病之一。目前对地中海贫血尚无有效的治疗方法，因此快捷有效的诊断技术在地中海贫血干预中极为重要。随着分子诊断学的不断发展，特别是基因诊断技术的应用，临床对地中海贫血的诊断、鉴定变得简单、准确[1]，使地中海贫血的基因诊断成为普遍的常规检测方法。本文就有关地中海贫血基因诊断研究进展作一综述。

1 α地中海贫血

α地中海贫血是由于α珠蛋白基因缺失，或非缺失突变导致α珠蛋白链功能异常，或合成减少而引起的一种遗传性溶血性疾病。目前世界上至少发现了35种缺失，中国人中发现了7种（3种α+地中海贫血和4种α0地中海贫血），最常见的为东南亚型（--SEA型）。少数α地中海贫血由基因突变引起，中国人最常见的3种为HbCS、HbQS和HbWM[2]。

1.1跨越断裂位点PCR（gap-PCR） 这是最常用的针对缺失型突变的检测方法。在α珠蛋白生成障碍性贫血中，以缺失型常见，除了常见的缺失类型外，也可能存在一些尚未发现的缺失型珠蛋白生成障碍性贫血，同样都可以利用gap-PCR技术进行分析和鉴定[3]。李友琼等[4]运用gap-PCR技术对1例罕见的巴氏水肿胎儿进行基因分析鉴定，表明针对大片段缺失的基因型，可以通过在其上、下游设计特异引物，利用gap-PCR技术进行分析和鉴定。结论证实gap-PCR技术可以用于鉴定未知缺失突变的珠蛋白生成障碍性贫血基因型。

1.2多重PCR（multiplex-PCR，M-PCR）多重PCR是基于gap-PCR原理设计的PCR技术，该技术可快速、准确检测α地贫的东南亚缺失（-SEA）、右缺失（-α3.7）和左缺失（-α4.2），具有简便快速、准确实用而又经济等特点，非常适合于我国以预防为主而开展的大人群地中海贫血的分子筛查和临床样品的基因诊断[5]。肖奇志等[6]研究提出单管多重PCR和反向斑点杂交（RDB）技术均能分别准确检出常见缺失型和非缺失型α-地贫各种突变类型，如将两者结合分析，还能提供相互佐证的重要信息，表明单管多重PCR结合RDB技术同时应用于α-地贫的基因诊断，可保证产前诊断的可靠性。

1.3实时荧光定量PCR（realtime PCR）该技术原理是在PCR反应体系中加人荧光基团，在特定的定量PCR仪上完成，利用荧光信号积累实时检测整个PCR进程，从而得到一条荧光扩增曲线，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法[7]。该方法具有检测快速、通量高、操作简便、不易污染等优点。彭建明等[8]通过将多重荧光定量PCR法与常用的gap -PCR法进行比较，无论是对正常标本还是对缺失型α地贫基因型的标本，检测结果都表现出100%的准确性，研究表明此方法操作快速准确，简单可行，低成本高通量，易于实现自动化及标准化，适应大规模检测。袁晓文等[9]采用双重TaqMan实时荧光嵌套PCR技术检测50份α地贫SEA缺失已知基因型标本，结果显示该方法不但能实现其快速分子诊断，而且能准确判断受检标本中的外源性污染，从而有效避免假阴性或假阳性误诊。Fallah等[10]建立的用于检测未知缺失类型α-地贫的实时荧光定量PCR可检测出72.4%的未知缺失类型α-地贫，不仅可用于检测α-珠蛋白基因的缺失，还适用于其他类型的基因分型。

1.4多重连接探针扩增法（ multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）该技术是另外一种可选择的用于检测未知缺失型地中海贫血的分子诊断技术。MLPA结合了DNA探针杂交和PCR技术，但也有其局限性：需要精确测量DNA的浓度，样本容易被污染；MLPA用于检测基因的缺失或重复，不适合检测未知的点突变类型[11]。Liu等[12]建立了以MLPA检测缺失型（-SEA、-α3.7，-α4.2）及非缺失型（α-CSα、α-QSα）α-地贫的方法，其检测的结果完全与多重PCR检测结果相一致。陈亚军等[13]对75份检出α地贫表型特征样本采用常规跨越裂点PCR（gap-PCR）技术及反向斑点杂交（RDB）法检测α地贫基因缺失及点突变，采用MLPA技术检测α珠蛋白基因缺失；产前诊断采用gap-PCR和MLPA法对胎儿标本进行α地贫基因缺失检测。得出结论：MLPA是α地贫基因缺失常规gap-PCR检测方法的有效补充，可防止α地贫基因缺失的漏诊及产前诊断中的假阳性或假阴性误诊。

2 β地中海贫血

β地中海贫血的分子基础是珠蛋白基因的点突变或核苷酸序列缺失，造成β珠蛋白链合成的减少或缺如。β珠蛋白基因突变主要分为两大类：一类是非缺失型突变，包括转录突变、RN加工突变、翻译突变、显性遗传性β地中海贫血和高度不稳定性血红蛋白、转录起始点突变、起始密码子突变、非翻译区突变、PolyA加合信号的突变。另一类是缺失型突变。目前世界范围内已报道200多种β基因突变类型，中国人中已发现34种，以 CD17（A→T）、CD41/42（-TTCT）、IVS-Ⅱ-654（C→T）、-28M（A→G）和CD71-72（+A）5种热点突变最多见，约占突变类型的90%[14]。

2.1反向点杂交（reverse dot blot，RDB） 该技术是目前国内外最常用的技术。其优点在于一张杂交膜上可同时筛查多种点突变，从而改变了传统杂交法一次只能检测一种突变的方式。尤其适合β地贫这类突变位点较多的遗传病的检测。李敏敏等[15]应用反向点杂交法检测出1种新的罕见β地中海贫血突变类型，即位于β珠蛋白exonl的CD27（GCC-GAC）突变。陈碧艳等[16]用同样的方法检测出罕见β珠蛋白-86（C>G）基因，丰富了中国人β地中海贫血的突变谱。赵华等[17]将PCR-RDB方法与血红蛋白电泳联合，对100 例临床标本进行检测，结果阳性率为46.8%，研究证实血红蛋白电泳联合基因诊断可以准确区分突变类型的纯合子、杂合子、双重杂合子及正常基因，是目前诊断β-地中海贫血患者和杜绝重型地中海贫血患儿出生之有效的实验方法。

2.2基于实时PCR的溶解曲线分析 近年来，基于实时PCR的溶解曲线分析方法检测地贫的突变基因在临床上受到越来越多的关注和应用。基于该技术主要有二类方法，①基于实时PCR的荧光标记探针溶解曲线分析（melting curve analysis，MCA），②高分辨率溶解曲线分析（high resolution melting analysis，HRM）。实时荧光PCR具有灵敏度高、重复性好、定量准确、自动化程度高、特异性更强和全封闭反应等优点。肖奇志等[18]采用针对我国β地贫24种基因突变的四色MCA试剂盒检测了187份临床标本，并与PCR-RDB进行对照，同时以DNA测序技术作为金标准进行了性能评价；结果显示诊断效率大于98%。研究还提出临床实验室特别是产前诊断实验室在采用RDB法检测β地贫基因突变时，很有必要同时应用基于PMCA技术对检测结果进行确证，以保证β地贫基因诊断和产前诊断结果的可靠性。严提珍等[19]也用同一方法检测了45l份外周血样本和84份胎儿绒毛、羊水、脐带血产前诊断样本，并与PCR-RDB进行对照，不一致者用基因测序法验证，结果显示该方法具有很好的诊断特性。廖灿等[20]对30例高风险胎儿家系进行HRM曲线分析，然后与RDB及DNA测序结果进行比对，结果完全一致，符合率为100%。研究证实基于MCA和HRM方法具有快速、简便、高通量、灵敏度高、特异性强、性价比高等优点，非常适合在临床上广泛开展应用。

2.3 DNA测序 是最直接最准确的判断突变的位置和性质的方法，尽管费用相对较高，仍然是检测未知的地贫突变基因的关键方法。通过设计突变位点两端的引物进行PCR，然后进行测序可以确定突变的具体位置和性质。目前，基因测序已经在地中海贫血稀有突变患者的产前诊断中有所应用，潘小英[21]等利用DNA 测序检测出5种β-地贫稀有基因突变型，分别是beta nt1582（A>G），PolyA（AATAAA>GATAAA）；CD13/14（-C）；beta nt 1586（A>G），PolyA（AATAAA>AATAGA）；IVS-1-1（G>T）；IVS-2-2（-T），其中前2种为新发现的β-地贫基因突变类型，得出结论：对常规基因检测技术不能诊断的β-地贫疑似病例，可作DNA测序进行确诊。宋春林[22]等检测出CD6、CD56、CD22 三种稀有β地贫突变，研究表明联合反向点杂交和直接基因测序技术可为携带稀有β地中海贫血基因突变的夫妇提供产前基因诊断。叶国永[23]等联合应用MLPA技术，PCR技术和基因测序技术检测100例临床样本，说明MLPA技术与基因测序技术的联合应用可用于临床常规应用。

3结论

基因诊断是地贫诊断的金标准。地中海贫血基因诊断技术经过多年的发展，已成为一项成熟的技术， 无论从速度、效果、敏感度、自动化程度、分析成本等方面，传统方法是无法比拟的。目前用于地贫基因诊断的方法较多，本文只叙述了其中几项，这些方法各有特色和优缺点，不同实验室可根据自身的技术优势和经验以及对患者疾病的判断等因素而考虑使用何种方法。基因诊断对操作人员和设备要求较高，应特别注意其稳定性和准确性。为提高地中海贫血诊断的准确性，减少误诊和漏诊，应将基因诊断法和其他方法有机结合起来。相信在不久的将来，地中海贫血的基因诊断技术将更加成熟、完善。

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编辑/张燕