多重耐药革兰阴性杆菌Ⅰ类整合子结构与功能分析

[摘要] 目的 探索Ⅰ类整合子在多重耐药的革兰阴性杆菌中的功能作用，并对其基因结构进行研究，为阐明革兰阴性杆菌的耐药机制和抑制耐药性的产生提供理论依据。 方法 选择温岭市妇幼保健院2009年7月～2011年10月的多重耐药革兰阴性杆菌80株，其中铜绿假单胞菌40株，鲍曼不动杆菌40株，使用K-B纸片法和双纸片协同实验对细菌的耐药性和超广谱β-内酰胺酶（ELSBs）的产生情况进行考察。对耐药且产ELSBs的细菌进行筛选，使用聚合酶链式反应（PCR）扩增实验、电泳法、整合酶Sourthen杂交实验对耐药细菌体内的Ⅰ类整合子存在情况、整合子基因结构、基因位置进行考察。 结果 药敏结果显示，40株铜绿假单胞菌中多重耐药且产ELSBs的菌株为27株，40株鲍曼不动杆菌中多重耐药且产ELSBs的菌株为28株。对多耐药且产ELSBs的菌株通过PCR扩增实验进行的Ⅰ类整合子存在情况的考察结果显示，40株鲍曼不动杆菌和40株铜绿假单胞菌中Ⅰ类整合子的阳性率分别为57.5%和55.0%。Ⅰ类整合子的保守区和可变区PCR扩增与测序分析结果显示，保守区内含有qaeE△1-F和sul 1-B这两种特征性基因片段，可变区内以长度为0.15、1.00、2.00、2.30 kb的基因片段出现频率最高，0.15 kb含有保守区内基因结果，其它基因片段依次为aadA、aaeA4、catB8这3种基因盒。 结论 Ⅰ类整合子与革兰氏阴性杆菌耐药性的产生有着密切的关系，qaeE△1-F和sul 1-B为Ⅰ类整合子基因保守区的特征性片段，两者同时出现则可确证该细菌体内含有Ⅰ类整合子。Ⅰ类整合子基因可变区内含有aadA、aaeA4、catB8三种出现频率最高的基因盒且长短为0.15 kb的基因片段含有保守区的基因结构，这3种基因盒和保守区基因片段的存在是导致细菌间耐药性平行转移的重要因素。

[关键词] 多重耐药性；革兰氏阴性杆菌；Ⅰ类整合子；基因扩增

[中图分类号] R446.5 [文献标识码] B [文章编号] 1673-7210（2013）04（c）-0091-04

抗生素作为治疗人类感染性疾病的主要药物，其临床有效性是人类健康的重要保障。但是目前因抗生素的滥用和使用不当导致出现大量的耐药细菌，细菌耐药性的存在大大降低了抗生素的临床治疗效果并大幅增加了疾病治疗的成本[1]。但是，因抗生素的研发周期较长，抗生素更新的速度远低于细菌耐药性产生的速度。目前，我国已成为当今世界抗生素滥用程度和使用量最大的国家[2]，并且每年都在大幅增加。在感染性疾病中，因革兰阴性杆菌[3]所致的疾病占主要比例，抑制革兰阴性杆菌耐药性的产生对于感染性疾病的治疗具有重要的临床意义。国外早在20世纪80年代末即对细菌耐药基因的水平传播进行了研究，并通过实验证细菌耐药基因的传播与一种称为整合子的移动基因原件有着密切的关系[4]。关于整合子，目前研究证实其为一类可特异性识别并捕获移动基因盒的基因重组系统，能够通过整合耐药性相关的基因盒而使细菌的耐药性在细菌间水平传播[5]。研究发现，在细菌中目前主要存在Ⅰ类、Ⅱ类、Ⅲ类这3种整合子[6]，且以Ⅰ类整合子的存在比例最大，该类整合子与细菌特别是革兰阴性杆菌的多重耐药性的产生有密切关系。探明Ⅰ类整合子在革兰阴性杆菌中的功能和其结构对于抑制细菌耐药性的产生、提高抗生素的治疗效果而言是一项重要的工作。本研究以多重耐药铜绿假单胞菌和多耐药的鲍曼不动杆菌为研究对象，对其体内的Ⅰ类整合子的功能和结构进行了研究分析，现报道如下：

1 材料与方法

1.1 菌株来源

选择温岭市妇幼保健院2009年7月～2011年10月的多重耐药革兰阴性杆菌80株，其中铜绿假单胞菌40株，鲍曼不动杆菌40株。分离自呼吸科病房15株（铜绿假单胞菌7株，鲍曼不动杆菌8株），肾内科病房12株（铜绿假单胞菌5株，鲍曼不动杆菌7株），消化科病房12株（铜绿假单胞菌9株，鲍曼不动杆菌3株），肿瘤科病房14株（铜绿假单胞菌6株，鲍曼不动杆菌8株），泌尿外科病房13株（铜绿假单胞菌5株，鲍曼不动杆菌8株），血液科病房14株（铜绿假单胞菌5株，鲍曼不动杆菌9株）。40株铜绿假单胞菌中，分离于血液标本5株，痰标本17株，尿标本9株，脓标本6株、其他3株；40株鲍曼不动杆菌中，分离于尿标本11株、痰标本7株、血液标本12株、脓标本7株，其他3株。细菌的筛选与纯化均由全自动微生物鉴定系统完成（法国梅里埃公司，VITEC-2 COMPACT），细菌纯度一致，无其他杂菌，对实验结果无影响。

1.2 试剂与仪器

主要试剂：琼脂（天跟生化公司），溴化乙锭（天跟生化公司），限制性内切酶 HinfⅠ（大连宝生物工程有限公司），琼脂糖（杭州天和微生物试剂有限公司），无菌蒸馏水（屈臣氏蒸馏水，经灭菌自制），2×Taq PCR Master Mix（大连宝生物工程有限公司），10×H buffer（大连宝生物工程有限公司），dNTP（杭州天和微生物试剂有限公司），DNA聚合酶（上海生工生物工程技术服务有限公司）、药敏纸片（OXOID公司生产，分别含有阿莫西林、阿莫西林-克拉维酸、头孢哌酮-舒巴坦、环丙沙星、亚胺培南、氨曲南、头孢克定、复方新诺明、链霉素、氯霉素、阿米卡星、头孢呋辛、头孢氨苄、头孢克肟、头孢西丁、链霉素、头孢他定等药物）。

主要仪器：无菌操作台（苏州净化设备厂生产），恒温水浴箱（天津大学精密仪器厂），ZF-302型紫外分析仪（梅特勒公司生产），M1706700PCR扩增仪（Thermo 公司生产），台式高速离心机（BECKMAN公司生产），恒温培养箱（永生生物仪器公司生产），电泳仪（北京六一仪器厂生产），凝胶成像分析系统（GIS-2010，上海天能科技有限公司）

1.3 研究方法

为阐明Ⅰ类整合子在革兰氏耐药杆菌中的功能与其结构，在本次研究中，首先对细菌的耐药性、耐压细菌产超广谱β-内酰胺酶（ELSBs）的情况进行了考察。筛选出耐药且产ELSBs的菌株后，通过PCR技术对Ⅰ类整合子的存在情况进行了考察，并通过电泳和基因测序以及Sourthen杂交实验对Ⅰ类整合子的基因结构、基因定位等方面进行了考察，具体方法如下所示：

1.3.1 实验试剂的配制

溴化乙锭（10 mg/mL）的配制方法为，精密称量溴化乙锭1 g，使用100 mL去离子水进行溶解，充分震荡直至其完全溶解，随后转入棕色容量瓶中，避光低温下保存，备用。琼脂糖凝胶的配制方法，精密称取理论量的琼脂糖，使用l×TAE缓冲液对其进行润湿，随后放入微波炉中使之融化，融化后待其冷却至60℃时，加入适量溴化乙锭溶液，充分震荡使之均匀，使制备的浓度为0.5 μg/mL。

1.3.2 药敏实验

在本次研究中，使用药敏实验对铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌的耐药性进行了评价。实验方法为纸片法，主要分为K-B纸片法药敏检测实验和双纸片协同实验[7]，前者测定受试菌株的药物敏感性，后者测定菌株体内ELSBs的存在情况。

1.3.2.1 K-B纸片法 将琼脂加热融化，制备无菌琼脂培养平板，板厚约1 cm，备用。将铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌用麦氏比浊管进行浓度校正，配制0.5麦氏浊度的细菌溶液，并将多余菌群滤去，使菌液均匀。随后，于无菌操作台内使用无菌棉签沾取标准浓度的细菌溶液，以涂布的方法将细菌接种于琼脂培养平板之中。平板接种后，将其置于室温下自然干燥3～5 min，随后将含有一定量抗生素药物的纸片紧贴于平板表明。圆形纸片中心距离约24 mm，纸片与平板内缘的距离保持在15 mm左右。纸片贴在培养平板以后，其中所含的药物在吸收琼脂内水平的情况下逐渐向四周扩散，形成具有递减特点的药物部分平板。纸片于琼脂平板上覆盖完全后，将其置于37℃温度下培养18 h。培养结束后根据最低抑菌浓度法（MIC）的原理并参照美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）标准[8]测量抑菌圈的大小，对铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌的耐药性进行评价。

1.3.2.2 双纸片协同实验 ELSBS是革兰阴性细菌中的耐药机制产生的一个重要因素，该酶的与Ⅰ类整合子的存在有着密切关系，对于阐述Ⅰ整合子阳性细菌多重耐药产生的原因有重要意义。在本次实验中，其操作为：使用麦氏比浊管制备0.5麦氏浊度的细菌混悬液，使用无菌操作方法将其均匀涂布于琼脂平板上，将含有阿莫西林-克拉维酸的含药纸片紧贴在平板中央，以该纸片为中心，于其周围25 mm处分别贴上含有头孢拉定、头孢曲松、头孢呋辛、氨曲南的药敏纸片作为ELSBS的指示剂，在35℃下对其进行培养18 h。平板培养完毕后，观察抑菌圈的变化，若抑菌圈朝着阿莫西林-克拉维酸方向有扩大现象，则说明该类菌株体内产生ELSBS。

1.3.3 Ⅰ类整合子基因PCR扩增

基因的扩增原理[9]为以目的基因的单链DNA为模版，在DNA聚合酶的作用下与含有3"、5"末端的互补DNA引物结合，按照半保留复制的扩增法则进行。在扩增过程中，DNA分子依次经历了变性、退火、延伸三个过程，并依次循环重复上述过程而逐渐实现DNA的扩增。在本次实验中，从耐药和产生ELSBs的两类耐药菌株中分别随机选取25株，共计50株，其进行PCR扩增时，分别对针对Ⅰ类整合子的保守区和可变区进行了相应的扩增，旨在实现对Ⅰ类整合子结构的分析。

1.3.3.1 基因模版的制备与扩增引物的设计 DNA的模版制备即为基因扩增的倒序行为，其过程则为延伸、退火、变性。本次研究中，使用煮沸法对DNA扩增模版进行了制备。具体操作为：将铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌于无菌条件下接种于琼脂培养平板上，37℃的温度下培养24 h。精密量取1 mL生理盐水加入麦氏比浊管中，随后使用无菌针挑取琼脂平板中的菌落，按照麦氏比浊法的操作方法制备5个麦氏浊度的细菌混悬液。所制备的菌液倒入离心管中，5000 r/min离心5 min，取上清液，随后加入300 μL无菌蒸馏水并置于水浴锅中煮沸10 min，煮沸后转入冰箱进行快速冷却3 min。菌液冷却后进行10 000 r/min离心10 min，将上清液除去，所制备的沉淀物即为DNA模版，转入-20℃冰箱内保存备用。

引物设计方面，参照GeneBank上所公布的基因序列和Ⅰ类整合子的整合酶结构特点，使用Primer Prernier 5.0软件分别对Ⅰ类整合子的保守区和可变区的引物进行了设计。可变区的上游引物结构为5"-GGCATCCAGGACGCAAGT-3"，下游引物结构为5"-AAGCAGATTGACCTGAG-3"，引物片段设计长度为800～3200 bp。保守区的上游引物结构为5"-ATCGCAArAGTTGGCGAAGT-3"（qaeE△1-F），下游引物结构为5"-GCAAGGCGGAAACCCGCGC-3"（sul 1-B），理论设计长度为800 bp。

1.3.3.2 Ⅰ类整合子保守区的PCR扩增 在DNA扩增时，其体系包括聚合引物、脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）、基因模版、DNA聚合酶以及含有Mg2+的缓冲溶液。基于此反应体系，在50 μL的PCR扩增反应室，分别加入0.5 μL Ex Taq溶液、5 μL的10×Ex Taq缓冲溶液、dNTP混合物5 μL，含有理论量上游引物溶液1 μL，DNA模版溶液4 μL，无菌蒸馏水33.5 μL。扩增条件为：95℃温度下预变性5 min，随后94℃温度下反应30 s，60℃保持30 s，72℃ 1 min，共计循环30次，最后在72℃的情况下使所扩增的DNA延伸10 min。

1.3.3.3 Ⅰ类整合子可变区的PCR扩增 对Ⅰ类整合子的保守区进行PCR扩增后，通过测定含有标志性基因片段qaeE△1-F和sul 1-B的阳性出现率筛选出Ⅰ类整合子阳性的多重耐药菌株。在Ⅰ类整合子阳性的铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌中随机抽取40株，每类细菌20株。根据“1.3.3.1”中的底物设计方法和模版制作方法设计底物，随后在可变区扩增反应体系中对Ⅰ类整合子的可变区进行PCR扩增。反应体系为（50 μL）：依次加入0.5 μL Ex Taq溶液、5 μL dNTP混合物溶液，5 μL 10×Ex Taq buffer、可变区上下游扩增引物各1 μL、随后加入4 μL DNA模板标准溶液并用无菌蒸馏水33.5 μL稀释至反应体积。循环参数为：95℃预变性3 min，94℃、62℃各30 s，72℃ 30 s，组后再72℃ 6 min，使扩增产物充分延伸，循环次数为30次。

1.4 扩增产物的结构分析

1.4.1 Ⅰ类整合子保守区的基因序列测定与分析

Ⅰ类整合子保守区PCR扩增后，取产物7 μL，使用Ph 8.0且含有0.50 μg/mL溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶对产物进行电泳分析，电压100V，电泳时间30 min，确定Ⅰ类整合子的典型扩增带，电泳后的PCR扩增产物经回收后送往专业测序机构进行纯化与测序。

1.4.2 Ⅰ类整合子可变区的基因测序与分析

Ⅰ类整合子可变区扩增产物经纯化后，取PCR产物8 μL、10×H buffer溶液2 μL、HinfI溶液1 μL（5 μg/μL）置于反应体系中，随后使用可变区基因限制性内切酶HinfⅠ对扩增产物进行酶切分析，于37℃下水浴处理4 h。酶切处理完成后，对其基因片段进行电泳分析，筛选出出现频率最高的片段，并将其送至专业测序公司进行纯化与测序分析。序列测定后，通过登录GeneBank进行基因比对，确定可变区内的基因盒种类。

1.5 整合子定位分析

为明确Ⅰ类整合子的具体位置，对所有Ⅰ类整合子阳性的菌株的整合子基因进行了Sourthen杂交实验。按照Sourthen杂交实验的操作方法和所用试剂盒的操作指南，对Ⅰ类整合子的基因定位进行了评价。

1.6 统计学方法

采用统计软件SPSS 13.0对数据进行分析，计数资料以率表示，采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

药敏实验结果显示，40株铜绿假单胞菌中出现多重耐药性的菌株为36株，40株鲍曼不动杆菌中出现多重耐药性的菌株为37株。ELSBs测定实验显示，36株多重耐药的铜绿假单胞菌中有27株产生ELSBs，占总菌株的百分比为67.5%（27/40），37株多耐药的鲍曼不动杆菌中28株产生了ELSBs，占总菌株的百分比为70.0%（28/40）。对耐药且产生ELSBs的细菌进行基因PCR扩增和测序的结果显示，25株多重耐药铜绿假单胞菌中同时出现基因片段qaeE△1-F和sul 1-B阳性的菌株23株，25株多重耐药的鲍曼不动杆菌中同时出现基因片段qaeE△1-F和sul 1-B阳性的菌株22株。保守区作为基因的非可变区域，其基因片段具有特异性的特点，qaeE△1-F和sul 1-B作为Ⅰ类整合子保守区的基因片段，当这两种片段同时出现时，即表示该类细菌体内含有Ⅰ类整合子。换言之，通过对Ⅰ类整合子的保守区基因的扩增和测序，最终结果显示，40株铜绿假单胞菌中Ⅰ类整合子阳性的菌株数为23株，阳性率为57.5%（23/40）；40株鲍曼不动杆菌中Ⅰ类整合子阳性的菌株数为22株，阳性率为55.0%（22/40）。此外，对保守区进行电泳实验结果显示，位于324 bp扩增带附近的基因序列可能为Ⅰ类整合子的基因区域。在Ⅰ类整合子可变区的扩增与测序方面，使用限制性内切酶对可变区基因扩增产物进行分酶切分析和电泳实验结果显示，长度为0.15、1.00、2.00、2.30 kb的基因片段出现的频率较高，经测序证实，0.15 kb含有Ⅰ类整合子保守区的基因结构qaeE△1-F和sul 1-B。1.00、2.00、2.30 kb长度的基因分别为aadA、aaeA4、catB8基因盒。Sourthen杂交实验结果显示，在所有Ⅰ类整合子阳性的菌株中，铜绿假单胞菌23株中Ⅰ类整合子位于质粒上的菌株共18株，比例为78.3%（18/23），22株鲍曼不动杆菌中Ⅰ类整合子位于质粒上的菌株共17株，比例为73.9%（17/23）。通过上述结果可以看出，革兰阴性细菌的耐药性、ELSBs的产生与Ⅰ类整合子的存在有着密切的关系。

3 讨论

细菌多重耐药性的产生，不仅大大增加了疾病治疗的成本，同时给抗生素的研发与使用也带来了巨大的压力。Ⅰ类整合子作为多重药性细菌体内的一个重要基因部件[10]，目前越来越多的研究证实其与细菌耐药性的遗传和变异有着密切的关系。在Ⅰ类整合子的检测方面，目前已PCR扩增技术为主，通过对Ⅰ类整合子基因保守区和可变区的基因结构的分析实现对Ⅰ类整合子功能和结构的研究。通过大量的研究证实，Ⅰ类整合子在胃肠疾病的致病菌中存在的比例较高，且以铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌较多[11]。在本次研究中，以铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌为研究对象，对Ⅰ类整合子在多耐药革兰阴性杆菌中的功能和其基因结构特点进行了研究与分析，使用药敏实验筛选出了多重耐药且产ELSBS的铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌，以筛选出的菌株为研究对象，通过PCR扩增和基因测序发现，qaeE△1-F和sul 1-B这两个基因序列为Ⅰ类整合子的保守区的特征基因序列，两种序列的同时出现即可判定该株细菌体内携带有Ⅰ类整合子。通过对比可发现，Ⅰ类整合盒子的阳性率与细菌的耐药性的出现有着较好的一致性。虽然有研究称，qaeE△1-F和sul 1-B两者出现一个即可判定细菌携带有Ⅰ类整合子，但有研究证实，qaeE△1-F和sul1-B的单一出现与整合子阳性检出之间并不具有相关性，说明细菌在耐药性产生的同时存在着变异的现象[12-13]。因此，在本次研究中，将保守区两种特征基因片段的同时出现作为Ⅰ类整合子的阳性检出凭证更为合理。保守区的基因测序和分析结果不仅证实了，qaeE△1-F和sul 1-B两种基因片段的存在，也从侧面证实了这两种基因片段为Ⅰ类整合子所必备的基因结构，是细菌多重耐压性产生的必要条件。

保守区的PCR扩增和测序结果显示，Ⅰ类整合子在324 kb扩增带处集中出现，且以0.15、1.00、2.00和2.30kb长度的基因片段的出现频率最高，通过测序证实0.15 kb基因片度还有Ⅰ类整合子保守区的结构，其他三种片度则对应着aadA、aaeA4、catB8这两种基因盒。该结果表明，可变区虽然为Ⅰ类整合子的基因可改变区域，但其所含的特征基因盒和携带的保守区的基因片段并不会出现大幅度改变，该性能也是保持Ⅰ类整合子基因传播功能的基础保障。Sourthen杂交实验发现大部分的Ⅰ类整合子位于细菌质粒上，这种基因定位方式为Ⅰ类整合子的完整传播特性也提供了结构保障[14-16]。

目前关于Ⅰ类整合子的研究还处于起步阶段，Ⅰ类整合子的结构和功能的研究依然无法满足抑制细菌耐药性产生的需要。在整合子的研究中，除了Ⅰ类整合子以外，也发现了Ⅱ类和Ⅲ类整合子，仅仅研究其中的一种对于完全阐释细菌耐药机制的产生是远远不够的。在将来的研究中，更为综合地研究细菌整合子的功能与结构以及探索新型的耐药机制相关的基因部件依然是当前细菌耐药研究领域中的一项重要任务。

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（收稿日期：2013-01-03 本文编辑：李继翔）