Ki67\GFAP在人脑恶性胶质瘤病理分级中的意义

[摘要] 目的 探讨Ki67、GFAP与人脑恶性胶质瘤病理分级的关系。 方法 取深圳市宝安区中医院病理科2007年1月~2012年12月组织学确诊为恶性胶质瘤标本31例，根据WHO（2007年）胶质瘤分级标准，分为胶质瘤Ⅱ级组、胶质瘤Ⅲ级组和胶质瘤Ⅳ级组，另取10名正常人脑组织胶质细胞作为正常对照组。免疫组织化学法检测Ki67及GFAP表达。 结果 Ki67表达水平在正常对照组最低，随着肿瘤WHO分级的增高而增高，在胶质瘤Ⅳ级组达高峰，差异有统计学意义（P < 0.05）；GFAP表达水平在正常对照组最高，随WHO分级的增高而降低，在胶质瘤Ⅳ级组表达水平最低，差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 Ki67、GFAP可作为人脑恶性胶质瘤病理分级及预后判断有价值的参考指标。

[关键词] 胶质瘤；Ki67；GFAP

[中图分类号] R73-3[文献标识码] A[文章编号] 1673-7210（2014）06（c）-0031-04

Significance of Ki67, GFAP in human brain m alignant glioma of different pathological grading

CHEN Meihua1 CHEN Guizhen1 JIA Wanjun1 ZOU Guihua2

1.Department of Pathology, Hospital of TCM in Bao"an District of Shenzhen City, Guangdong Province, Shenzhen 518100, China; 2.Department of Pathology, the People"s Hospital of Bao"an District in Shenzhen City, Guangdong Province, Shenzhen 518100, China

[Abstract] Objective To study the correlation betweem Ki67, GFAP expression and pathological grading of human brain m alignant glioma. Methods 31 cases of m alignant glioma specimens confirmed by histology in Hospital of TCM in Bao"an District of Shenzhen City were collected from January 2007 to December 2012, while divided into glioma Ⅱ, Ⅲ and Ⅳ grade groups according to WHO (2007) glioma grading standards. Another 10 cases of normal brain tissues were selected as control group. Then the expression of Ki67, GFAP was detected by immunohistoehemistry. Results The expression of Ki67 in normal control group was the lowest, which increased with the increase of WHO grading of tumors, reached a peak in glioma Ⅳ grade group, the difference was statistically significant (P < 0.05). The expression level of GFAP in normal control group was the highest, which decreased with the increase of WHO grading of tumors, reached a bottom in glioma Ⅳ grade group, the difference was statistically significant (P < 0.05). Conclusion Ki67 and GFAP can be regarded as valuable markers to judge the pathological grading and prognosis.

[Key words] Glioma; Ki67; GFAP

人脑胶质瘤是严重威胁人类健康的疾病，其临床病理分级对其治疗和预后均有指导意义，目前公认的分级方法是依据肿瘤组织异型性、坏死、微血管增生程度来确定，具有很大的主观性。病理学需要寻找可以用于胶质瘤病理分级的客观指标。日常病理诊断常需要检测Ki67，以观察肿瘤的增殖情况，也检测GFAP以观察肿瘤的去分化情况，但是将二者结合起来评估胶质瘤恶性程度，作为胶质瘤病理分级的客观指标的研究目前没有报道。本研究采用免疫组化方法检测了Ki67、GFAP在脑胶质瘤中的表达，并用病理图像分析仪及统计学方法对免疫组织化学检测结果进行分析，探讨Ki67及GFAP与人脑恶性胶质瘤恶性程度的关系及其在临床病理分级中的意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本收集

所有标本采集均由深圳市宝安区中医院（以下简称“我院”）医学伦理委员会批准。

1.1.1.1 人脑胶质瘤组织标本取我院病理科2007年1月~2012年12月组织学确诊为恶性胶质瘤（WHOⅡ~Ⅳ级）标本31例，其中，男13例，女18例，年龄23~56岁；组织学分型：星形胶质细胞瘤29例，少突胶质细胞瘤2例。所有病例均为首次发病，术前未经化疗、放疗或其他治疗。

1.1.1.2 正常人脑组织标本取我院脑外伤开颅手术途径必须去除部位的正常脑组织10例作为正常对照组。

1.1.2 仪器与试剂

免疫组织化学试剂一抗兔抗人单克隆抗体Ki67和GFAP、SP试剂盒及DAB显色试剂盒均来自福建麦新公司。病理图像分析采用中山大学法医系YC.TY-2050型法医病理图像分析系统，定量测量（灰度域0~256，0为白，放大倍数10×20）。

1.2 方法

1.2.1 HE染色

所有标本均由4%甲醛固定，常规石蜡包埋，4 μm厚连续切片，切片经60℃烤片、二甲苯脱蜡、梯度酒精水化后，苏木精染色10 min，流水冲洗；盐酸酒精分化数秒，流水冲洗；伊红染色3 min，水洗；梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树脂胶封片。

1.2.2 免疫组织化学染色

免疫组化染色均采用SP法，常规脱腊至水。①采用高压修复抗原的方法，蒸溜水水洗3 min，2次；②3%H2O2，室温20 min，PBS缓冲液洗3 min，3次；③血清封闭37℃水浴10 min；④加入一抗（1∶200工作浓度），4℃冰箱过夜；⑤4℃冰箱取出室温放置10 min后，37℃水浴20 min，PBS缓冲液洗5 min，3次；⑥加入二抗，37℃水浴20 min，PBS缓冲液洗5min，3次；⑦加入链酶菌抗生素蛋白-辣根过氧华物酶复合物，37℃水浴20 min，PBS缓冲液洗5 min，3次；⑧DAB显色，苏木精复染，中性树胶封片。以PBS替代一抗做阴性对照。

结果判断：肿瘤组织中GFAP呈棕黄色，着色部位为细胞浆和细胞膜；Ki67呈棕黄色，着色部位为细胞核。采用YC.TY-2050型病理图像分析系统做定量测量，每张切片随机取5个视野，分别测定Ki67、GFAP阳性反应物面积密度、灰度值。

1.3 胶质瘤病理分级

依据WHO（2007年）胶质瘤分级标准，WHO Ⅱ级：肿瘤浸润性生长，无明显的细胞学恶性证据；WHO Ⅲ级：组织学上有恶性证据，如细胞密度增加、核的异型性、核分裂，出现微血管增生；WHO Ⅳ级：具有明确细胞学上恶性表现，如核分裂显著增多、坏死，微血管增生显著。

1.4 统计学方法

应用SPSS15.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HE染色

正常对照组无胶质细胞增生，细胞无异型（图1A）。恶性胶质瘤组织表现为肿瘤细胞弥漫浸润性生长，细胞形态多样，可见核分裂，部分细胞密度高，微血管增生，部分病例见组织坏死，并见栅栏状坏死。依照WHO（2007年） 胶质瘤分级标准，对每例标本进行重新组织学级别评估，WHOⅡ级12例（图1B），WHO Ⅲ级10例（图1C），WHOⅣ级9例（图1D）。

A：正常对照组；B：胶质瘤Ⅱ级组；C：胶质瘤Ⅲ级组； D：胶质瘤Ⅳ级组

图1 HE染色结果

2.2 免疫组织化学结果

恶性胶质瘤全部31例标本Ki67均呈阳性表达，正常对照组Ki67几乎无表达（图2A）；胶质瘤Ⅱ级组可见少量Ki67阳性表达（图2B）； 胶质瘤Ⅲ级组Ki67阳性表达较胶质瘤Ⅱ级组强（图2C）； 胶质瘤Ⅳ级组Ki67阳性表达最强（图2D）。

恶性胶质瘤全部31例标本GFAP呈阳性表达，正常对照组GFAP呈强阳性表达（图3A）；胶质瘤Ⅱ级组细胞GFAP呈强阳性表达（图3B）；胶质瘤Ⅲ级组细胞GFAP表达较胶质瘤Ⅱ级组弱（图3C）； 胶质瘤Ⅳ级组细胞GFAP呈弱阳性或无表达（图3D）。

Ki67和GFAP面积密度在对照组、胶质瘤Ⅱ级组、胶质瘤Ⅲ级组和胶质瘤Ⅳ级组间差异有统计学意义（P < 0.05），其中，Ki67面积密度随胶质瘤组织病理学分级增高而增高，各组间比较差异均有统计学意义（P < 0.05），GFAP面积密度随胶质瘤组织病理学分级增高而减弱，各组间比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。见表1。

A：正常对照组；.B：胶质瘤Ⅱ级组；C：胶质瘤Ⅲ级组； D：胶质瘤Ⅳ级组

图2 Ki67、GFAP免疫组织化学染色

A：正常对照组；B：胶质瘤Ⅱ级组；C：胶质瘤Ⅲ级组； D：胶质瘤Ⅳ级组

图3 GFAP免疫组织化学染色

表1 Ki67、GFAP免疫组化染色图像分析（x±s）

注：与正常对照组比较，aP < 0.05；与胶质瘤Ⅱ级组比较，bP < 0.05；与胶质瘤Ⅲ级组比较，cP < 0.05

3 讨论

胶质瘤是严重威胁人类健康的高度恶性肿瘤，发生于神经外胚层，起源于神经间质细胞，即神经胶质、室管膜、脉络丛上皮，依其病理类型和所在部位不同，病程长短不一，自出现症状至就诊时间一般多为数周至数月，少数可达数年。胶质瘤恶性程度高的后颅窝肿瘤病史多较短，病变进展迅速。肿瘤如有出血或囊肿形成，症状发展进程可加快，有的甚至可类似脑血管病的发展过程。胶质瘤临床症状主要为两方面：①颅内压增高和其他一般症状，如头痛、呕吐、视力减退、复视、癫痫发作和精神症状等；②脑组织受肿瘤的压迫、浸润、破坏所产生的局部症状，造成神经功能缺失。目前对神经胶质瘤的治疗以手术为主，但由于肿瘤浸润性生长，与脑组织间无明显边界，除早期肿瘤小且位于适当部位者外，难以做到全部切除，一般主张综合治疗，即术后配合以放射治疗、化学治疗等，可延缓复发及延长生存期。晚期手术困难，危险性大，并常遗有神经功能缺失。

本研究选取的恶性胶质瘤标本均为WHO Ⅱ级及以上，病理组织学上具有浸润性生长，不同程度的微血管增生，细胞核异型，核分裂增多，组织、细胞坏死的表现。但这些指标都具有一定的主观性，因而人们一直致力于寻找具有客观性的医学指标[1-2]来对恶性胶质瘤进行病理分级。

Ki67系细胞增殖相关蛋白，由分子质量为345 000和395 000的两种成分组成，基因编码位于10号染色体。Ki67的表达反映细胞核增殖活性，自细胞进入G1期开始表达，在G2、M期表达最强，G0期不表达。目前逐渐取代PCNA成为检测细胞增殖指数的指标[3-4]。冯晓莉等[5]研究发现，肾透明细胞癌Ki67指数约为6.67%，其指数与肿瘤分级、DNA倍体异常显著相关；Ki67指数越高，肿瘤分级越高，DNA呈现异倍体；但与其他临床病理指标无显著相关性。Arshad等[6]研究认为，Ki67对于胶质瘤临床分期及组织病理分级均有重大意义。邢涛等[7]发现，Ki67是参与脑胶质瘤恶性发展的重要分子生物学因子。本研究结果表明，随着胶质瘤WHO分级增高，即肿瘤的恶性度增高，Ki67的表达水平增高，并且其增高在不同WHO分级中差异有统计学意义（P < 0.05）。这一研究结果与前述研究结果一致，可以认为，Ki67能够作为胶质瘤组织病理分级的客观指标。

Ki67作为肿瘤细胞核增殖指数可以应用到许多恶性肿瘤的组织病理分级中，但对胶质瘤不具备特异性。因此，同时也要寻找一种能够代表肿瘤分化方向的细胞因子，与Ki67结合起来既能反映肿瘤恶性程度，又能直观反映胶质瘤肿瘤类型[8-9]。GFAP是一种分子量为51 kDa的中间丝蛋白[10]，其特异性地表达在正常胶质细胞、反应性和肿瘤性星形胶质细胞、少突胶质细胞、室管膜细胞，而在神经节细胞、神经元、成纤维细胞中不表达[8-9，11-12]，临床病理中常用于鉴别脑肿瘤的分化方向。本研究表明，GFAP的在正常脑组织以及WHO Ⅱ~Ⅳ级胶质瘤细胞中均表达，并且具有随着肿瘤分级增高而表达减弱的趋势。本研究结果与周金桥等[13]的研究一致。

综上所述，笔者认为，Ki67联合GFAP应用有可能成为胶质瘤组织病理分级及预后判断的有价值的指标。

[参考文献]

[1]程世翔，涂悦，孙洪涛，等.神经突触核蛋白-1在人脑胶质瘤中的表达[J].中华神经外科杂志，2013，29（5）：469-472.

[2]崔建和，柏根基，郭莉莉.脑胶质瘤ADC值及H1-波谱与病理分级的相关性研究[J].重庆医学，2011，40（14）：28-33.

[3]姜振富，李梅，韦鸿，等.脑胶质瘤中Ki-67、Kras和Braf蛋白的表达及临床意义[J].现代肿瘤医学，2013，21（3）：507-510.

[4]Mar CK，Eimoto T，Nagaya S，et al. Cell proliferation marker MCM2，but not Ki67，is helpful for distinguishing between minimally invasive follicular carcinoma and follicular adenoma of the thyroid [J]. Histopathotogy，2006，48（7）：801-807.

[5]冯晓莉，鲁海珍，孙耘田.肾透明细胞癌中Ki-67指数、EGFR表达及DNA倍体的临床意义[J].临床肿瘤学杂志，2009，14（6）：505-509.

[6]Arshad H，Ahmad Z，Hasan SH. Gliomas：correlation of histologic grade，Ki67 and p53 expression with patient survival [J]. Asian Pac J Cancer Prev，2010，11（6）：1637-1640.

[7]邢涛，张利勇，王丽.共刺激分子B7-H3和Ki-67在人脑胶质瘤中的表达及相关性[J].中华神经医学杂志，2011， 10（6）：557-559.

[8]Middeldorp J，Hol EM.GFAP in health and disease[J]. Prog Neurobiol，2011，93（3）：421-443.

[9]Elobeid A，Bongcam-Rudloff E，Westermark B，et al. Effects of inducible glial fibrillary acidic protein on glioma cell motility and proliferation [J]. J Neurosci Res，2000，60（2）：245-256.

[10]Gerth AMJ，Deighton RF，McCulloch J，et al. Proteomic studies in low-grade gliomas：what have they informed about pathophysiology?[J]. Diffuse Low-grade Gliomas in Adults，2013，2：117-136.

[11]Chen F，Becker AJ，Loturco JJ. Contribution of Tumor Heterogeneity in a New Animal Model of CNS Tumors [J]. Mol Cancer Res，2014，5（2）：1213-1241.

[12]Wei P，Zhang W，Yang LS. Serum GFAP autoantibody as an ELISA-detectable glioma marker [J]. 2013，34（4）：2283-2292.

[13]周金桥，刘秋红，王景涛.过氧化物酶1，6和GFAP在人脑星形胶质细胞瘤中的表达及临床意义[J].南方医科大学学报，2012，32（9）：1255-1259.

（收稿日期：2014-04-03本文编辑：程铭）