草鱼肠炎病病原菌的分离鉴定

摘要：根据患病草鱼(Ctenopharyngodon idellus)的临床症状，解剖分析，初步判断为草鱼肠炎病。为确诊该病，从患病草鱼采集组织进行实验室检查，分离得到病原菌CQWL001，按常规方法进行形态特征、培养特性、主要生化及动物试验，确定该病的病原菌为肠型点状气单胞菌。

关键词：草鱼；肠型点状气单胞菌；分离；鉴定

中图分类号：S943.112文献标识码：A文章编号：0439-8114(2008)07-0824-02

草鱼肠炎病是一种由致病菌引起的常见传染病，发病频率很高，对水产养殖危害特别严重[1]。已有研究表明，引起草鱼肠炎疾病的细菌主要为气单胞菌属，包括嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、豚鼠气单胞菌，单独或混合感染引发肠炎[2]。本研究对临床症状为肠炎的草鱼进行解剖，分离后得到1株草鱼肠炎病病原菌，通过形态学观察、染色特性、生化试验等方法对其进行鉴定，并对其进行了人工回归感染试验，旨在初步弄清草鱼肠炎病病原菌的菌属问题，为诊断和防治该病提供依据。

1材料与方法

1.1材料

患肠炎病草鱼取自重庆市永川区双竹渔场，带回实验室进行分离培养。健康草鱼购自重庆市永川区双竹渔场，平均体重为35±5 g，在实验室内驯养1周后用于试验。驯养和试验期间，每日以自制人工饵料喂食1次，养殖用水为曝气6 d的自来水，pH 值7.2，水温22±1℃，溶氧7.3～8.1 mg·L^-1。肠杆菌科细菌生化鉴定管及其他细菌生化鉴定所需试剂购自中国人民解放军浙江省军区后勤部卫生防疫检验所；常规药品均为本实验室自备。

1.2方法

1.2.1病原菌的分离纯化无菌条件下解剖濒临死亡的患肠炎病的草鱼，采集病鱼鳃、肝、肾和腹水，用研钵碾碎组织并制成组织悬液，挑取组织悬液在普通琼脂平板上划线，37℃培养过夜，挑选形态结构、颜色相同的单个菌落，在平板上再次划线分离纯化。斜面中生理盐水保存4℃备用。

1.2.2病原菌的形态学观察观察分离纯化的菌落形态并进行涂片，革兰氏染色，硝酸银鞭毛染色，光学显微镜观察。用标准测微尺测定病原菌大小。

1.2.3病原菌的鉴定将分离纯化的病原菌接种于各种鉴定试剂管和配置的营养液中，37℃过夜培养，根据标准管比较观察结果。病原菌鉴定参考伯杰氏(Bergey’s)细菌鉴定手册[3]。

1.2.4人工感染试验将试验鱼放在1.0 m×0.6 m×0.8 m的水族箱中驯养，在其胸鳍基部注射浓度为106 CFU·mL^-1的纯菌液，饲养96 h后，观察受试鱼的致病症状，并进行病理检查。

1.2.5病原菌的毒力测定将分离纯化的病原菌接种于液体培养基中培养过夜，采用紫外分光光度计测定病原菌浓度。按照等对数间距法将菌液浓度稀释为10⁵、10⁶、10⁷、10⁸和10⁹ CFU·mL^-1 5个浓度梯度试验组，每组草鱼10尾，每尾鱼腹腔注射0.5 mL菌液，对照组每尾鱼注射等量无菌生理盐水，3个重复。在1.0 m×0.6 m×0.8 m的水族箱中饲养观察96 h，试验期间不投饵，并及时清污。记录发病症状及死亡情况，按Karber统计法计算96 h LC50。

2结果与分析

2.1病原菌的分离纯化及形态学观察

从患肠炎病草鱼中分离出致病菌CQWL001。普通营养琼脂平板上生长的菌落，灰白色、半透明、光滑、湿润。该病原菌在革兰氏染色后显微镜观察为革兰氏阴性、短杆状细菌，大小为0.3～0.4×0.6～0.9 μm，无芽孢(图1)。

2.2病原菌的生化鉴定

病原菌生化鉴定试验检测了10种糖，其中棉子糖、鼠李糖、木糖、乳糖显阴性，其他均显阳性。而检测的甘露醇、卫矛醇、肌醇、山梨醇、侧金盏醇5种醇，除了甘露醇显阳性以外，其余均显阴性。其他检测指标都为阳性(表1)。根据伯杰氏(Bergey’s)细菌鉴定手册，鉴定分离出来的草鱼肠炎病致病菌为肠型点状气单胞菌。

2.3感染试验

病原菌毒力试验结果显示，注射病原菌的草鱼均在96 h内发病，染病草鱼精神委靡，游动缓慢，懒散，厌食。外观检查发现病鱼腹部膨胀，肛门红肿、外凸。解剖检查，病鱼轻微腹水，肠道发炎，肠壁充血，肠腔内有淡黄色黏液。此症状与所收集的肠炎病草鱼症状基本一致。回收病原菌，其形态、染色特性、生化特性与自然病例分离的致病菌相同。

2.4分离菌株的毒力

草鱼感染肠炎病致病菌96 h后的致死情况如表2 所示。经病理检查，试验过程中死亡的病鱼均出现肠炎病的症状，因此确定为肠型点状单胞菌感染致死。采用Karber法计算半致死浓度，获得肠型点状气单胞菌对草鱼的96 h LC₅₀为10⁶ CFU·mL^-1。

3讨论

从患病草鱼组织内分离出来的致病菌CQWL001，经形态学、染色特性和生化试验，检索伯杰氏细菌鉴定手册，鉴定为肠型点状气单胞菌。本试验首先采用肠杆菌科细菌生化鉴定管进行鉴定，得出初步结果后再作进一步鉴定。生化鉴定结果及病原菌形态特性与李军等[4]的研究结果相一致。

肠型点状气单胞菌为条件性致病菌，广泛存在在水体和淤泥中，具有很强毒力，腹部注射96 h后LC₅₀为10⁶ CFU·mL^-1。草鱼处在良好环境及健康状态时，鱼体内的肠型点状气单胞菌未能迅速繁衍，故无发病症状。当水环境发生改变(如水质恶化、溶氧低、氨氮高等)时则引起鱼的抵抗力下降，该病原菌便会在肠内大量繁殖，导致肠炎病爆发。本研究分离纯化的病原菌能使草鱼感染，其发病症状与自然发病的症状相同，并可引起死亡。从病死草鱼的组织中回收到与分离病原菌相同的细菌，说明该分离菌是引起草鱼肠炎发病死亡的病原菌。

草鱼肠炎病对养殖生产危害较大，草鱼肠炎病病原菌的分离与鉴定，有利于养殖水产疾病的诊断和预防。在养殖生产中，对草鱼肠炎病主要的防治措施有西药治疗、中药治疗以及综合防治等。笔者提倡采用综合防治措施，并建议在用药前对病原菌进行分离和药敏测定后选择敏感药物使用[5]。

参考文献：

[1]徐伯亥，熊木林，韩先朴，等.二龄草鱼肠炎病的研究[J]. 水生生物学报，1987，11(1)：73-82.

[2]陈翠珍，张晓君，房海.草鱼肠炎的病原菌检验与分析[J].中国兽医科技，1999，29(1)：5-7.

[3]布坎南 R E.伯杰细菌鉴定手册(第8版)[M].北京：科学出版社，1984.

[4]李军，闵正沛，徐伯亥，等.草鱼肠型点状气单胞菌的分离和鉴定[J].水利渔业，2007，27(2)：107-108.

[5]张晓君，陈翠珍，房海.草鱼肠炎嗜水气单胞菌分离株的主要特性及系统发育学分析[J].中国人兽共患病学报，2006，22(4)：334-338.