黄鳝载脂蛋白apoAI基因的克隆及序列分析

材料，提取总ＲＮＡ，利用同源克隆技术获得了黄鳝的载脂蛋白ａｐｏＡＩ基因的部分编码区（ＧｅｎＢａｎｋ登录号：ＨＱ６０３７８２）和３′ＵＴＲ，其ｃＤＮＡ序列长度为１ １４５ ｂｐ，其中编码区长度为７７２ ｂｐ，编码２５６个氨基酸。序列同源性分析表明，黄鳝的ａｐｏＡＩ基因的氨基酸序列与其他鱼类的ａｐｏＡＩ基因的氨基酸序列具有非常高的同源性，是载脂蛋白家族的一个新成员。黄鳝ａｐｏＡＩ基因的克隆为进一步深入研究该基因的功能积累了基础资料，在黄鳝育种及医药研制方面具有潜在的应用价值。

关键词：黄鳝（Ｍｏｎｏｐｔｅｒｕｓ ａｌｂｕｓ）；载脂蛋白；ａｐｏＡＩ；克隆；序列分析

中图分类号：Ｑ７８５；Ｑ９５９．４８２文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）21－4500-03

Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Aｎ ａｐｏＡＩ Ｇｅｎｅ ｉｎ Ｒｉｃｅ Ｆｉｅｌｄ Ｅｅｌ

Ｍｏｎｏｐｔｅｒｕｓ ａｌｂｕｓ

ＱＩＵ Ｑｉｎｇ－ｃｈｏｎｇ，ＧＥＮＧ Ｘｉａｏ－ｘｕｅ，ＬＩＵ Ｃｈｅｎｇ－ｄｕ，ＳＵＮ Ｗｅｎ－ｘｉｕ

（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｙａｎｇｔｚｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｊｉｎｇｚｈｏｕ ４３４０２５， Ｈｕｂｅｉ， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｐａｒｔ ｏｆ ｃｏｄｉｎｇ ａｎｄ ３′ ＵＴＲ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ａｐｏＡＩ ｇｅｎｅ （ＧｅｎBａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ： ＨＱ６０３７８２） ｗａｓ ｃｌｏｎｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ｌｉｖｅｒ ＲＮＡ ｏｆ ｒｉｃｅ ｆｉｅｌｄ ｅｅｌ （Ｍｏｎｏｐｔｅｒｕｓ ａｌｂｕｓ）． Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｌｅｎｇｔｈ ｏｆ ｔｈｉｓ ｃＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ waｓ １ １４５ ｂｐ， ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ７７２ ｂｐ ｃｏｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ ａｎｄ ｅｎｃｏｄｅｄ ２５６ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ． Ｈｏｍｏｌｏｇｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ｈｉｇｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ Ｍｏｎｏｐｔｅｒｕｓ ａｌｂｕｓ ａｎｄ other ｆｉｓｈｅｓ’ ａｐｏＡＩ ｇｅｎｅｓ， ｗｈｉｃｈ were ｂｅｌｏｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｆａｍｉｌｙ． Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｏｎｏｐｔｅｒｕｓ ａｌｂｕｓ’ ａｐｏＡＩ ｇｅｎｅ ｇａｖｅ ｔｈｅ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｆｕｒｔｈｅｒ ｉｎｖｅｒｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｉｔｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎ， ａｎｄ ｈａd ｔｈｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ Ｍｏｎｏｐｔｅｒｕｓ ａｌｂｕｓ’ ｂｒｅｅｄｉｎｇ ａｎｄ ｍｅｄｉｃａｌ ｕｓａｇｅ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｍｏｎｏｐｔｅｒｕｓ ａｌｂｕｓ； ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ； ａｐｏＡＩ； ｃｌｏｎｉｎｇ； ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ

黄鳝广泛分布于亚洲东南部，是一种普遍的淡水食用鱼，具有很高的营养价值和经济价值，现已成为长江流域主要省分水产养殖业的主导产业之一［１］。黄鳝的饲料代谢对黄鳝的科学养殖具有重要意义，一直是生产实践和科研工作的难点和热点之一［２－４］。许多学者研究了饲料中的蛋白质和脂肪含量对黄鳝生长的影响，但由于受黄鳝规格、饲料中的脂肪来源以及实验水温等因素的影响，其结果存在较大差异［２，４，５］。有研究［６］指出，饲料中的能量和蛋白质含量与动物机体的脂类代谢密切相关。因此，寻找与脂类代谢相关的生理指标对于确立饲料中蛋白质和脂肪对黄鳝生长的影响具有重要的意义。载脂蛋白是携带脂肪的主要载体，是构成血浆脂蛋白的蛋白质组分，其基本功能是运载脂类物质及稳定脂蛋白的结构，某些载脂蛋白还具有激活脂蛋白代谢酶、识别受体等功能［７］。在各种载脂蛋白中，载脂蛋白ＡＩ（Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ＡＩ）是一种主要的载脂蛋白，其可能是参与脂蛋白代谢和维持正常血清脂类代谢平衡的核心载脂蛋白［８］。目前，与黄鳝脂类代谢相关的载脂蛋白基因及其功能的研究鲜见报道。本研究以黄鳝肝脏为研究材料，通过同源克隆获得了其载脂蛋白ａｐｏＡＩ基因的序列，并对其ｃＤＮＡ序列进行了分析，以期为深入研究黄鳝载脂蛋白ａｐｏＡＩ基因的功能提供基础资料。

１材料与方法

１．１实验材料

实验用黄鳝购自荆州市西门菜市场，质量约１００ ｇ，解剖后取其肝脏并迅速放入液氮中冷冻，然后转入－８０ ℃超低温冰箱中保存备用。提取ＲＮＡ所用的Ｔｒｉｚｏｌ和ＡＭＶ Ｒｅｒｖｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓ购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；ｐＭＤ１８－Ｔ载体、ｒＴａｑ ＤＮＡ聚合酶、ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ ＤＬ２０００等购自ＴａＫａＲａ公司；ＤＮＡ凝胶回收试剂盒购自Ｏｍｅｇａ公司；Ｘ－ｇａｌ、ＩＰＴＧ、琼脂糖、酵母提取物、胰蛋白胨等购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ ５α为长江大学生命科学学院分子生物学实验室保存；其余生化试剂均为国产分析纯。

１．２方法

１．２．１引物设计及合成参照已报道的其他鱼类的ａｐｏＡＩ基因设计了１对简并引物用来扩增黄鳝的ａｐｏＡＩ基因，引物序列为ＡＰＯ１（上游引物）５′－ＣＣＴＣＴＫＧＣＴＣＣＴＧＣＴＧＧＣＴＴＴＣ－３′ 和ＡＰＯ２（下游引物）５′－ＴＧＣＣＧＡＡＴＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＧＣ－３′。引物由ＴａＫａＲａ公司合成，用无菌水稀释成１００ ｐｍｏｌ／Ｌ，置于－２０ ℃冰箱备用。

１．２．２黄鳝肝组织ＲＮＡ的提取及ＲＴ－ＰＣＲ反应黄鳝肝组织的总ＲＮＡ提取采用Ｔｒｉｚｏｌ试剂盒，按说明书进行。ＲＴ－ＰＣＲ反应参照ＴａＫａＲａ ＲＮＡ ＰＣＲ Ｋｉｔ （ＡＭＶ） Ｖｅｒ ３．０试剂盒的说明书进行。在１０ μＬ的反转录体系中分别加入以下组分：ＭｇＣｌ２ ２ μＬ、１０× ＲＴ Ｂｕｆｆｅｒ １ μＬ、ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ ｄＨ２Ｏ ３．７５ μＬ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（均为１０ ｍｍｏｌ／Ｌ）１ μＬ、ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ０．２５ μＬ、ＲＮＡ １ μＬ、ＡＭＶ Ｒｅｒｖｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ０．５ μＬ、Ｏｌｉｇｏ ｄＴ－Ａｄａｐｔｏｒ ｐｒｉｍｅｒ ０．５ μＬ。ＲＴ－ＰＣＲ的反应条件为：３０ ℃ １０ ｍｉｎ，４５ ℃ ３０ ｍｉｎ，９９ ℃ ５ ｍｉｎ，５ ℃ ５ ｍｉｎ。

根据反转录试剂盒说明书配制ＰＣＲ反应体系，包括ｃＤＮＡ ５ μＬ、５× ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ５ μＬ、ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ ０．１２５ μＬ、上游引物０．２５ μＬ、下游引物０．２５ μＬ、灭菌蒸馏水１４．３７５ μＬ。ＰＣＲ反应条件为：９４ ℃预变性２ ｍｉｎ；９４ ℃变性３０ ｓ，５４ ℃退火３０ ｓ，７２ ℃延伸２ ｍｉｎ，共３５个循环；最后于７２ ℃延伸１０ ｍｉｎ。扩增产物用质量浓度为１％的琼脂糖凝胶电泳检测。

１．２．３黄鳝ａｐｏＡＩ基因的克隆及序列分析ＰＣＲ扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，切取目的条带，进行回收纯化。回收的ＤＮＡ与ｐＭＤ１８－Ｔ载体连接。重组质粒转化到感受态Ｅ． ｃｏｌｉ ＤＨ ５α细胞中，均匀涂在含氨苄青霉素、ＩＰＴＧ和Ｘ－ｇａｌ的ＬＢ平板上，３７ ℃过夜培养。随机挑取白色菌落，用菌液ＰＣＲ法筛选阳性克隆，并送交上海博尚公司进行测序。

采用ＤＮＡＭＡＮ软件将所得到的ＤＮＡ序列翻译成氨基酸序列，并将其与从ＧｅｎＢａｎｋ中获取的其他鱼类基因的氨基酸序列进行多重比对。运用ＭＥＧＡ２软件中的Ｎ－Ｊ法构建系统进化树。

２结果与分析

２．１黄鳝ａｐｏＡＩ基因的ｃＤＮＡ扩增

通过Ｔｒｉｚｏｌ提取的总ＲＮＡ保持完整，进行反转录后用上述设计的简并引物扩增ｃＤＮＡ，产物用质量浓度为１％的琼脂糖凝胶电泳，结果如图１所示，目的片段长约１ ２００ ｂｐ，和预计扩增大小相符。

２．２黄鳝ａｐｏＡＩ基因ｃＤＮＡ测序结果

将用引物ＡＰＯ１和ＡＰＯ２扩增得到的ｃＤＮＡ片段连接到载体ｐＭＤ１８－Ｔ上，通过质粒扩增及酶切鉴定的阳性转化子送公司测序得到了一个长度为

１ １４５ ｂｐ的片段（图２），其序列已提交至GenBank，登录号为HQ603782。在本实验中，根据其他鱼类的ａｐｏＡＩ基因所设计的上游引物位于基因的编码区，而下游引物位于基因的３′ ＵＴＲ。因此，扩增得到的１ １４５ ｂｐ的基因片段应包含部分的编码区和３′ ＵＴＲ。序列分析表明，该基因片段含有的编码区长度为７７２ ｂｐ，编码２５６个氨基酸，３′ ＵＴＲ长３７３ ｂｐ，并且在３′ ＵＴＲ区域有典型的真核生物加尾信号ＡＡＴＡＡＡ。因此，实验所获得的序列可能包含ａｐｏＡＩ基因完整的３′ ＵＴＲ区域。

２．３黄鳝ａｐｏＡＩ基因的进化分析

将预测得到的ａｐｏＡＩ基因的氨基酸序列与其他鱼类ａｐｏＡＩ基因的氨基酸序列进行了同源性比对，其同源性非常高；利用Ｎ－Ｊ法构建了系统进化树（图３）。结果表明，裸盖鱼、石鲷鱼、牙鲆、星斑川鲽、军曹鱼、斜带石斑鱼、鳝鱼７种鱼聚为一类，虹鳟、花■、斑点叉尾■３种鱼聚为一类。由此可见，ａｐｏＡＩ基因在不同物种间存在一定的差异，但各物种间的遗传差异并不太大，充分体现了ａｐｏＡＩ基因在物种遗传进化中的高度保守性，这与ａｐｏＡＩ基因的作用是紧密相连的。

３讨论

载脂蛋白ＡＩ是高密度脂蛋白（ＨＤＬ）中的主要成分，几乎所有的ＨＤＬ均含有载脂蛋白ＡＩ，其水平可直接反映体内ＨＤＬ的水平，且对ＨＤＬ的功能至关重要［７］。载脂蛋白在脂蛋白代谢中具有重要的生理功能。医学研究发现，载脂蛋白ＡＩ具有多种生理功能，包括抗动脉粥样硬化、抗氧化、抗炎以及抗内毒素作用［９，１０］，甚至基于载脂蛋白ＡＩ能与肝细胞表面受体特异性结合的特性，可以将其作为靶向药物的载体［１１］，因此被认为是ＨＤＬ功能的主要承担者。许多学者在饲料中脂肪含量对黄鳝生长的影响方面开展了大量的研究工作并获得了不少成果，但其结果存在较大差异。目前，通过测定黄鳝内源载脂蛋白分子活性来反映饲料中脂肪和蛋白质含量对黄鳝生长的影响的研究尚未见报道；而且，关于黄鳝载脂蛋白基因的研究报道也较少。本研究利用ＲＴ－ＰＣＲ及Ｔ－Ａ克隆技术得到了黄鳝ａｐｏＡＩ基因的部分编码区，其ｃＤＮＡ序列长１ １４５ ｂｐ，编码２５６个氨基酸；序列同源性分析表明，该基因属于载脂蛋白家族的新成员。黄鳝ａｐｏＡＩ基因的克隆为进一步深入研究该基因的功能积累了基础资料，在动物育种及医药研制方面具有潜在的应用价值。

参考文献：

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